许家宝，贾晓彤，陆世海，崔靖康，焦晓波，王梓源，崔建东*

（1.天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.山东大树达孚特膳食品有限公司，山东 菏泽 274511）

芝麻渣是芝麻籽榨油后的副产品。通常，每加工1 t芝麻即可获得1 t左右的湿芝麻渣，由于芝麻渣水分含量高（64%），营养成分丰富，因此特别适合微生物的生长，在气温较高的季节，如果不及时进行清理，就会霉变发臭，污染环境。但是当前芝麻渣主要被加工用作饲料或肥料，没有实现高值化利用。研究表明，芝麻渣中的蛋白质含量高达40%～46%，是一种营养丰富的植物蛋白[1]，由于缺乏芝麻蛋白深加工产品的跟进和研发，导致芝麻蛋白的利用率极低。通过研究表明，蛋白质经过蛋白酶水解后得到的多肽比原蛋白质具有更好的营养特性，而且蛋白多肽能够以更快的速度通过小肠黏膜，更易被人体吸收[2-3]。酶解产生的蛋白多肽具有多种生理活性功能，如降血脂、抗氧化、抗菌和提高免疫力等作用[4-5]。因此，将芝麻渣中的蛋白质提取出来，通过蛋白酶水解制备成蛋白活性多肽，对于提高芝麻渣高值化利用具有重要意义。

此外，近期的研究证实天然蛋白质经酶解后生成的多肽与金属元素螯合形成的多肽金属螯合物可通过小肠直接被人体吸收[6-7]，该螯合物在细胞液作用下螯合键断开，分解为小肽或氨基酸以及金属离子进入血液，不仅能起到补充矿物质元素的作用，而且还能发挥多肽的生理活性功能。例如，Guo等[8]在小鼠饲料中添加胶原肽-钙螯合物，喂食4周后，测定各项指标，结果表明胶原肽-钙螯合物提高了小鼠股骨密度、骨钙的含量，效果均显著优于碳酸钙。Chen等[9]研究在缺钙小鼠饲料中添加罗非鱼鱼鳞蛋白多肽-钙螯合物，结果表明其与酪蛋白磷酸肽具有类似的生理活性。Bi等[10]制备了鹿骨肽-钙螯合物，发现其在回肠里（pH 7.0，37℃）是稳定的。以上结果表明，蛋白多肽-钙螯合物不仅有利于钙在体内的吸收，而且在补钙的同时还能发挥活性多肽的生理功能，是一种极具开发前景的补钙营养强化剂。基于此，本研究以芝麻蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合水解芝麻蛋白，得到芝麻蛋白多肽，并将其螯合制备成芝麻蛋白多肽螯合钙，考察其对小鼠的补钙效果及其活性功能，本研究为芝麻渣的高值化利用提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芝麻渣（干基蛋白含量40%）：河北多祥益植物油有限责任公司；碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（50 U/mg）、水合茚三酮、葡萄糖酸钙、甘氨酸、乙二胺四乙酸二钠、丙酮（以上均为分析纯）、血钙检测浓度试剂盒、组织及血液碱性磷酸酶活性检测试剂盒：索莱宝生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（2 000 U/mg）、氢氧化钠、铬蓝黑R指示剂、抗坏血酸（以上均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；风味蛋白酶（30 U/mg）（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；无水氯化钙（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）：天津市化学试剂三厂；昆明小鼠：天津杰柯逊生物技术开发有限公司。

1.2 主要仪器设备

DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器：江苏金怡仪器科技有限公司；FE20K实验室pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；Vortex-Genie2旋涡混合器：美国SI公司；H1650台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV-5100紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；KQ500E超声波分散仪：昆山舒美超声仪器有限公司；LGJ-60A真空冷冻干燥机；上海豫明仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芝麻蛋白多肽的制备

1.3.1.1 芝麻蛋白的提取及预处理

参考文献[11]的方法，使用低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）法提取芝麻渣中蛋白。称取5 g芝麻蛋白于锥形瓶中，然后加入10 mL蒸馏水匀浆，使用超声波分散仪在超声功率400 W下超声处理30 min后，将蛋白分散于水中，在25℃下搅拌8 h～12 h，使其充分扩散形成蛋白悬浊液。

1.3.1.2 单一蛋白酶水解芝麻蛋白

将预处理后的芝麻蛋白悬浊液分别调至碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶的最适温度和pH值，再分别加入上述蛋白酶，控制加酶量为底物质量的4%，25℃水浴酶解3 h。沸水浴10 min终止反应，冷却至25℃，用1mol/L HCl调节pH值至7.0，8 000 r/min离心10 min，取上清液，用蒸馏水稀释后采用茚三酮比色法测定水解度[12]。

1.3.1.3 双酶复合水解芝麻蛋白

将预处理后的芝麻蛋白水溶液按照表1的顺序酶解，在相应温度和pH值下进行第一阶段水解3 h后，调整温度和pH值，进行第二阶段水解，3 h后，沸水浴10 min终止反应，冷却至25℃，用1 mol/L HCl调节pH值至7.0，8 000 r/min离心10 min，取上清液，用蒸馏水稀释后采用茚三酮比色法测定水解度。

表1 双酶复合水解芝麻蛋白Table 1 Compound hydrolysis of sesame protein by double proteases

1.3.1.4 木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合水解芝麻蛋白的单因素试验

以芝麻蛋白水解度为指标，分别研究底物浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），pH 值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），温度（40、45、50、55、60 ℃），加酶量（1%、2%、3%、4%、5%）对双酶复合水解芝麻蛋白的影响。水解后得到的芝麻蛋白多肽溶液，经过真空冷冻干燥机冻干成粉末备用。

1.3.1.5 酶解芝麻蛋白水解度的测定

采用茚三酮比色法测定水解度。建立甘氨酸标准曲线：准确称取甘氨酸0.1 g于锥形瓶中，加入适量蒸馏水溶解均匀，定容到100 mL容量瓶中；取8支试管，分别将甘氨酸标液稀释至 2、4、6、8、10、15、20 μg/mL。然后分别取上述甘氨酸标准液2 mL于试管中，加入1 mL茚三酮显色剂，混匀后，100℃水浴锅中加热15 min，冷却至25℃后放置15 min，以空白管调零，在570 nm波长下测定吸光度。以甘氨酸的浓度（μg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标作图，即得水解度测定的甘氨酸标准曲线，曲线方程为y=0.055 2x-0.025 4，R2=0.997 1。

利用标准曲线可计算水解蛋白液中的游离氨基含量（μmol/mL），然后通过下式计算蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）。

式中：A1、A2为水解液和蛋白溶液测定的吸光值；m为蛋白质质量，mg；MGly为甘氨酸相对分子质量，75.07 g/mol；htot为每克芝麻蛋白所含肽键的毫摩尔数，7.6 mmol/g[13]。

1.3.2 芝麻蛋白多肽螯合钙的制备及分析

1.3.2.1 采用单因素试验制备芝麻多肽螯合钙

向50 mL锥形瓶中分别加入一定量的芝麻蛋白多肽与CaCl2，质量比4∶1，加入一定体积蒸馏水，调节pH值为7，在25℃下搅拌1h后5000r/min离心10min，向上清液中加入5倍反应液体积的乙醇，25℃条件下静置一段时间，待有沉淀生成后以8 000 r/min离心10 min，收集沉淀，用去离子水洗2次后，加入20 mL去离子水制备成多肽-钙螯合物悬浮液。以钙螯合率为指标，分别研究芝麻蛋白多肽与氯化钙质量比（2∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、6 ∶1），pH 值（4、5、6、7、8），螯合温度（25、30、40、50、60 ℃）和螯合时间（20、30、40、50、60 min）对钙螯合率的影响。

1.3.2.2 芝麻多肽螯合钙中钙螯合率测定

乙二胺四乙酸二钠盐（ethylene diamine tetraacetic aciddisodium salt，EDTA-2Na）与钙在碱性条件下形成金属络合物，可用于测定样品中钙浓度[14]。利用EDTA滴定法，在达滴定终点时，溶液呈现游离指示剂的颜色，根据EDTA用量，可以计算出样品中钙的含量。螯合物中钙含量的测定：吸取1 mL多肽-钙螯合物悬浮液于试管中，涡旋振荡均匀后加入1 mL NaOH，再滴加铬蓝黑R3滴～4滴，混合均匀后用0.01 mol/L EDTA标准溶液滴定，根据消耗EDTA的体积，计算出钙的含量。螯合率的计算方法如下。

1.3.2.3 红外光谱分析

采用溴化钾（KBr）压片法，利用傅里叶变换红外光谱仪进行红外扫描，得到芝麻多肽和芝麻多肽螯合钙的红外光谱图。将芝麻蛋白多肽和芝麻蛋白多肽螯合钙分别与KBr按质量比1∶150混合压片，扫描范围为400 cm-1～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次。

1.3.3 芝麻蛋白多肽螯合钙饲喂小鼠应用实验

1.3.3.1 动物处理

选取三周龄昆明小鼠48只，雌雄各半，将其随机平均分为6组。A为对照组、B为芝麻多肽-钙螯合物组、C为葡萄糖酸钙组、D为碳酸钙组、E组为抗坏血酸（VC）组，F为芝麻蛋白多肽组。灌胃给药，每日13：00～14：00灌胃1次，每次药剂量分别为1 g/kg小鼠体重，其中VC组为0.5 g/kg小鼠体重，对照组为蒸馏水（1 g/kg小鼠体重）。实验期为28 d[9]，期间喂食常规饲料，自由进食。

1.3.3.2 检测指标与方法

1）血样采集：试验结束后，使用镊子摘除小鼠眼球进行放血，至小鼠血液放尽后停止，用1.5 mL离心管接血。采集的血液以4 000 r/min离心15 min，取上层血清至离心管中，放置于-20℃冰箱中保存，用于各血清指标的测定。

2）血清钙的测定：采用血钙浓度检测试剂盒检测。

3）血清碱性磷酸酶的测定：采用组织及血液碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性检测试剂盒检测。

4）骨骼采集处理和股骨指标测定：小鼠取血后，剔除小鼠腿部毛发，然后剥去小鼠股骨连附的肌肉组织，取出小鼠的左侧股骨，测量其长度和直径。利用丙酮脱脂处理股骨8 h～10 h后，80℃条件下烘至恒重，称量股骨干重。根据浮力原理用天平称重，测量股骨体积，计算单位体积内股骨质量，即骨密度。

5）骨钙的测定：用硝酸将样品溶解，再经微波消解，取适量稀释后的消解液用原子吸收法测钙含量[15]，计算骨钙含量。

1.4 数据处理与分析

所有数据采用SPSS 22软件进行方差分析，显著差异检测限P<0.05，应用Origin软件对试验数据进行作图分析，每组试验样品测定3次。

2 结果与分析

2.1 芝麻蛋白多肽的制备

2.1.1 蛋白酶组合的筛选

不同蛋白酶水解和双酶复合水解芝麻蛋白的效果见图1。

图1 不同蛋白酶水解和双酶复合水解芝麻蛋白的效果Fig.1 Effect of different single-protease and double-proteaseson the hydrolysis of sesame protein

由图1 a可知，在各蛋白酶最适水解条件下，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的水解度较高，其中单一的中性蛋白酶水解度最高，达到10.53%，而单一碱性蛋白酶水解效果最差，水解度为2%。研究表明，碱性蛋白酶对蛋白质中的羧端疏水氨基酸有较强的专一性，更适合用来酶解碱溶酸沉法制备的植物蛋白[16]。而本研究用DES法提取芝麻蛋白时可能影响到了碱性蛋白酶对芝麻蛋白的专一水解位点，导致其水解度下降。由图1 b可知，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶在不同添加顺序条件下复合水解芝麻蛋白的水解度相似，分别为19.82%和20.92%，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶不同添加顺序下复合水解芝麻蛋白的水解度分别为12.89%和14.00%，风味蛋白酶与中性蛋白酶不同添加顺序下复合水解芝麻蛋白的水解度分别为12.58%和13.65%。结果表明，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合水解芝麻蛋白的效果优于单一蛋白酶和其他蛋白酶的复合水解效果。因此确定最佳酶解条件为同时添加木瓜蛋白酶与风味蛋白酶。

2.1.2 双酶水解芝麻蛋白的单因素试验

双酶水解芝麻蛋白的单因素试验结果见图2。

图2 双酶水解芝麻蛋白单因素试验结果Fig.2 Single factor test results of double-proteases hydrolysis of sesame protein

由图2 a可知，随着温度从40℃升高至50℃，芝麻蛋白水解度逐渐提升，当温度为50℃～60℃时，水解度降低。这是因为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的最适催化温度均为50℃[17-18]，当温度逐渐升高时，达到了两种蛋白酶的最适催化温度，从而芝麻蛋白的水解度达到最高；当温度进一步升高时，蛋白酶的空间结构及功能受到影响，活性降低，不利于芝麻蛋白的水解。因此确定最适水解温度为50℃。由图2b可知，随着pH值升高，蛋白水解度呈现出先升高后降低的趋势，在pH值为6.5～7.0时达到最大；当pH值在7.0～7.5时，水解度呈下降趋势。这是因为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的最适催化pH值为6和7[19-20]，在最适pH值下，蛋白酶的活性最高，因而芝麻蛋白的水解度最高；当体系的pH值偏离最适pH值时，蛋白酶的活性降低，不利于芝麻蛋白的水解。因此确定最佳水解pH值为6.5。由图2c可知，当底物浓度从0.5%升高至2.5%，水解度呈先升高后降低的趋势。当底物浓度较小时，提高底物浓度，酶与底物接触概率变大，水解度增加；当底物浓度过大时，酶解体系的黏度高，导致部分底物不能与酶接触，并且部分酶被底物包裹，从而使芝麻蛋白水解度受到影响。因此选择最佳底物浓度为1.0%。由图2d可知，加酶量在1%到3%时，水解度明显增加，当加酶量在3%到5%时，水解度变化不大。当酶的浓度较低时，提高加酶量，会使酶与底物接触概率增加，从而使水解度增大；进一步提高加酶量，达到了底物饱和的最大酶浓度，芝麻蛋白的水解度不再提高，因此确定加酶量为3%。在各单因素最适条件下，水解度最高位21.09%。

2.2 芝麻蛋白多肽螯合钙的制备

2.2.1 芝麻蛋白多肽螯合钙制备的单因素试验

芝麻蛋白多肽螯合钙制备的单因素试验结果见图3。

图3 芝麻蛋白多肽螯合钙制备的单因素试验结果Fig.3 Single factor test results of the preparation of sesame protein peptide chelated calcium

由图3a可知，随着多肽与氯化钙质量比从2∶1提升至5∶1时，螯合率也随之升高，并达到最大值；继续增大多肽质量，螯合率提升不大。这是因为当多肽与氯化钙的质量比较小时，大部分钙离子未参与螯合。随着多肽与氯化钙的质量比的增大，螯合率达到最高值，继续增大多肽质量，由于此时多肽浓度已达饱和，螯合率不再继续提升。初步确定多肽与氯化钙质量比为5∶1作进一步优化。由图3b可知，螯合时间为20 min时，螯合率已达到67%，可见螯合反应是一个较为迅速的反应。继续增加螯合时间，螯合率不再提升，因此确定螯合时间为20 min。如图3c所示，当pH值从4增加到7时，螯合率逐渐上升，当pH7时螯合率最高，达到72%，继续增大pH值，螯合率下降。可见pH值对螯合率的影响较大，过酸或过碱都不利于多肽-钙螯合物的形成。原因可能是当H+大量存在时，H+会与Ca2+竞争供电子基团，羧基配位能力较弱，不利于螯合物的形成[21]；当OH-存在时，Ca2+会与其生成Ca（OH）2沉淀；在中性条件下，配体受 H+和 OH-较小，提供了充分的供电子基团，有利于与Ca2+通过配位键形成螯合物。因此确定最佳螯合pH值为7。如图3d所示，随着螯合温度的升高，螯合率逐渐增加，在40℃时最高；当螯合温度继续增加时，螯合率呈下降趋势。当螯合温度较低时，螯合反应速度慢，螯合率较低；因此适当提高温度能提高多肽与Ca2+碰撞的概率，提高螯合率。由于多肽与金属离子的螯合是一个放热反应，螯合温度过高不利于螯合反应的进行，同时高温可能会导致多肽发生羰氨反应，减少Ca2+螯合位点。因此确定最佳螯合温度为40℃。张磊等[22]利用鹿骨胶原多肽制备多肽螯合钙，在pH 6、酶解液与氯化钙溶液体积比2∶1、螯合温度40℃，螯合时间50 min条件下，最大螯合率为51.6%。周小敏等[23]制备了金枪鱼骨胶原多肽螯合钙，在pH 6.0、温度55℃、螯合时间40 min、胶原多肽与氯化钙质量比1∶1的条件下，最高螯合率达到88%。本研究制备的芝麻多肽螯合钙在多肽与氯化钙质量比为5∶1，pH7.0，螯合温度40℃，螯合时间20 min条件下，最大螯合率为75%。这些结果表明不同种类的蛋白多肽制备的多肽螯合钙螯合率有较大差距，多肽的种类对螯合率有较大影响。

2.2.2 芝麻蛋白多肽螯合钙红外光谱分析

多肽和多肽螯合物的红外光谱见图4。

图4 多肽和多肽螯合钙的红外光谱Fig.4 FTIR spectra of peptide and peptidechelated calcium

由图4可以看出，芝麻蛋白多肽在与钙螯合后，整个波形发生了移动。在特征区，氨基（N-H）的伸缩振动峰由3 428 cm-1移到3 410 cm-1，说明芝麻蛋白多肽的N-H键发生了化学变化，可能是由于N-H与Ca2+配位引起N-H拉伸和氢键被取代。C=O的吸收峰在1 651 cm-1，而多肽螯合钙吸收峰蓝移至1 643 cm-1；-COO-的吸收峰在1 411 cm-1，多肽螯合钙的吸收峰红移至1 377 cm-1，可能是由于Ca2+与-COO-反应形成-COOCa[24]，说明氨基和羧基均参与了螯合反应。这些现象说明钙与多肽的C=O、N-H和-COO-结合，形成了稳定的多肽螯合钙。

2.3 芝麻蛋白多肽螯合钙的小鼠灌胃实验

2.3.1 小鼠股骨计量学变化

各组小鼠股骨指标结果见表2。

表2 各组小鼠股骨指标Table 2 Femur indexes of rats in each group

股骨的状况间接反映了全身的骨骼状况，骨密度是用于评价骨质疏松症和骨折危险度的重要指标[25]。由表2可以看出，服用多肽螯合钙（B）组小鼠在股骨质量、长度和密度方面均高于服用葡萄糖酸钙（C）、碳酸钙（D）、VC（E）和对照组（A）。表明芝麻蛋白多肽螯合钙不仅具有较好的补钙效果，而且在促进小鼠股骨生长，提高股骨密度的效果优于传统的补钙剂葡萄糖酸钙、碳酸钙和VC。

2.3.2 小鼠股骨和血液中钙含量变化

各组小鼠骨钙和血钙含量见图5。

图5 各组小鼠骨钙和血钙含量Fig.5 Bone calcium and blood calcium content of rats in each group

骨钙的含量是决定骨密度的重要因素[26]。由图5a可以看出，服用多肽螯合钙（B）、葡萄糖酸钙（C）和碳酸钙（D）的小鼠骨钙含量均高于对照组（A）、VC（E）和芝麻蛋白多肽（F），而且，服用多肽螯合钙（B）的小鼠骨钙含量最高，表明服用芝麻蛋白多肽螯合钙能明显增加小鼠股骨中钙含量，其补钙效果优于葡萄糖酸钙和碳酸钙。

血清钙含量受肠道对钙的吸收、骨钙融出以及甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）[27]、降钙素[28]等激素调节的影响。钙的有效补充可以维持正常血钙水平，抑制PTH水平的增加，血钙降低说明钙未得到有效吸收，出现钙平衡失调，因此血钙的含量可以用来评价补钙剂在小鼠体内的吸收利用情况。由图5b可以看出，服用多肽螯合钙（B）、葡萄糖酸钙（C）和碳酸钙（D）的小鼠血液中的钙含量均高于对照组（A）、VC（E）和芝麻蛋白多肽（F），而且，服用多肽螯合钙（B）的小鼠血钙含量最高，表明服用芝麻蛋白多肽螯合钙能明显增加小鼠血液中的钙含量。

2.3.3 小鼠血清AKP活性变化

各组小鼠血清AKP活性见图6。

图6 各组小鼠血清AKP活性Fig.6 Serum AKP activity of rats in each group

血清中的AKP主要来自骨骼，是成骨细胞的产物和反映骨代谢的重要指标[29-30]。当成骨细胞变为骨细胞时，血清AKP含量减小，活性下降。并且在一些疾病状态时AKP释入血清，使血清AKP含量和活性增加。由图6可以看出，服用多肽螯合钙（B）、葡萄糖酸钙（C）和碳酸钙（D）的小鼠血液中的AKP活性均低于对照组（A）、VC（E）和芝麻蛋白多肽（F），表明芝麻蛋白多肽螯合钙、葡萄糖酸钙和碳酸钙均可以有效降低血清AKP活性，对股骨钙化具有促进作用。

3 结论

本研究所得芝麻蛋白的最佳水解条件为采用木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合水解、温度50℃、pH6.5、底物浓度1%、加酶量3%，在此条件下水解度最高为21.09%。制备芝麻蛋白多肽螯合钙的最佳螯合工艺：多肽与CaCl2的质量比5∶1、温度40℃、pH7.0、螯合时间20 min，在此条件下，多肽钙螯合率最高达到75%。通过对芝麻蛋白多肽和芝麻蛋白多肽螯合钙的傅里叶红外光谱图进行分析发现钙与多肽的C=O处及末端的N-H和-COO-处结合，表明芝麻蛋白多肽和钙成功发生了螯合。通过小鼠灌胃实验发现，与对照组（蒸馏水灌胃）相比，芝麻蛋白多肽螯合钙对小鼠股骨生长有促进作用，提高了骨钙含量，且效果优于葡萄糖酸钙和碳酸钙；提高了小鼠体内血钙含量，降低了碱性磷酸酶（AKP）活性。本研究为芝麻蛋白及其钙补充剂的开发利用提供了科学依据。