郭冰倩，王逸夫，郭雅婕，叶 雨，黄 燕，陈虹霏，蒋永华，莫曾南△

（广西医科大学 1.基因组与个体化医学研究中心；2.再生医学与医用生物资源开发应用协同创新中心；3.第二附属医院，南宁 530021）

近年来，随着单细胞测序技术的发展使得人们能够从单细胞层面研究不同组织的细胞构成、发育轨迹及细胞相互作用[1-3]。其中单细胞悬液制备是单细胞测序技术的关键环节[4]。使用不同单细胞悬液的制备方法可以得到不同的细胞类型，Schneider等[5]研究表明，与酶解离人类睾丸组织相比，机械解离后体细胞标记基因ACTA2和VIM的表达显著降低，精原细胞标记基因FGFR3和SALL4的表达增加。肾上腺组织由多种细胞构成，如类固醇细胞，髓质细胞，它们的祖细胞，免疫细胞及各种间质细胞[6]。本文使用了3 种单细胞悬液的制备方法，比较了不同方法的单细胞数量、活性及相对基因表达水平，为肾上腺组织单细胞悬液的制备提供了一种最佳的方法。

1 材料与方法

1.1 标本 取来自广西医科大学第二附属医院的手术终止妊娠的16～18 孕周胎儿肾上腺组织3 例，该研究已经过广西医科大学第二附属医院伦理委员会同意（批件号：KY-0096），受试者签署了知情同意书，放置转移液（含10% 胎牛血清和1% 双抗的RPMI 1640）中转移至实验室。

1.2 试剂与仪器 RPMI 1640 培养基，胎牛血清（FBS），台盼蓝染液，双抗和Hank's 平衡盐溶液（HBSS）购自美国Gibco 公司；杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）和磷酸盐缓冲液（PBS）购自加拿大Wisent公司；Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶和DNase Ⅰ购自瑞士罗氏公司；红细胞裂解液购自美国Biolegend公司，100 μm滤网和40 μm滤网购自美国BD 公司；牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司；CYP17A1 抗体购自美国Santa cruz 公司；CHGA抗体购自美国赛默飞公司；偶联荧光集团488 驴抗小鼠二抗和偶联荧光集团647驴抗小鼠二抗购自英国Abcam 公司。电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），超净工作台，离心机（Eppendorf 公司，德国），显微镜（OLYMPUS 公司，日本），荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士），流式细胞仪（C6 Plus，BD公司，美国）。

1.3 单细胞悬液的制备 使用电子天平对肾上腺组织进行称重，将每例肾上腺组织分为3 份（各0.1 g），使用D-PBS清洗两次后，分别使用3种消化方案（A 方案：HBSS 溶液中加入1 mg/mLⅠ型胶原酶，0.1 mg/mL DNase Ⅰ；B 方案：HBSS 溶液中加入1 mg/mLⅡ型胶原酶，0.1 mg/mL DNase Ⅰ；C 方案：HBSS 溶液中加入1 mg/mL Ⅳ型胶原酶，0.1 mg/mL DNase Ⅰ）进行消化，在37 ℃水浴锅中温柔晃动消化20 min，加入含10%FBS 的RPMI 1640 培养基终止消化，使用100 μm滤网过滤，300 g离心5 min，然后加入PBS清洗后离心弃上清，细胞沉淀加入红细胞裂解液，冰上裂解5 min，加入含1% FBS 的DPBS 终止裂解，使用40 μm 滤网过滤，300 g 离心5 min，然后加入PBS清洗后离心弃上清，细胞沉淀使用含1%BSA的PBS重悬。

1.4 台盼蓝染色 取10 μL 细胞悬液与台盼蓝染液1∶1 混合，室温下反应2 min，取混合液滴加入计数板中，计算细胞数与细胞存活率。

1.5 mRNA 测序及数据分析 对使用3 种消化方案得到的细胞（2 个生物学重复）使用Trizol 法提取总RNA，然后富集mRNA，逆转录形成双链cDNA后纯化并构建文库。将文库送至上海伟寰生物科技有限公司进行测序，测序平台为Illumina Nova-Seq。对下机后的原始数据进行过滤，得到高质量Reads并使用FastQC对过滤后数据进行质量评估分析。通过HISAT2软件将过滤后数据与人类基因组进行比对，并利用String Tie软件重构转录本。利用R语言DESeq2 工具包进行差异表达分析，筛选标准为：P.adjust＜0.05 且|log2FoldChange|＞1，然后进行KEGG通路分析。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）3 种消化方案得到的细胞使用Trizol 法提取RNA，然后使用Prime Script RT reagent Kit（日本TaKaRa公司）逆转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒（日本TaKaRa 公司）说明书进行反应体系配置和DNA扩增，得到CT值后计算2-ΔΔCT得到目的基因相对表达量。使用的引物序列见表1。GAPDH引物购自捷尼斯生物。

表1 目的基因及引物序列（5'～3'）

1.7 流式细胞分析 取3 种消化方案制备的单细胞悬液，设为实验组，使用fixation buffer（美国Biolegend）室温避光固定20 min，随后用1X Intracellular Staining Perm Wash Buffer（美国Biolegend）清洗2 次，1 500 r/min 离心5 min 后使用100 μL 1X Intracellular Staining Perm Wash Buffer 重悬。然后分别加入CYP17A1、CHGA 抗体室温反应30 min，阴性对照组加入PBS，然后用1X Intracellular Staining Perm Wash Buffer 清洗2 次，1 500 r/min 离心5 min。随后分别加入偶联荧光集团647、488的二抗室温反应30 min，然后用1X Intracellular Staining Perm Wash Buffer 清洗2 次，1 500 r/min 离心5 min，用500 μL PBS重悬上机检测。使用flowjo 10.5.3软件进行结果分析。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 进行统计学分析和绘图，所有计量资料均以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey法。RT-qPCR和流式结果采用双因素方差分析，两两比较采用Tukey法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同消化方案对细胞形态的影响 镜检观察可发现A 方案、B 方案消化得到的单细胞悬液结团少、形态完整、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净，而C 方案消化得到的单细胞悬液有少量结团，见图1。

图1 人肾上腺组织单细胞悬液镜检

2.2 不同消化方案对细胞数量和存活率的影响 使用不同消化方案消化人肾上腺组织得到的单细胞数和细胞存活率组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。A 方案消化得到的单细胞数（2.94±0.59）×105与B 方案消化得到的单细胞数（3.72±0.60）×105比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而与C 方案消化得到的单细胞数（5.41±0.20）×105相比，A 方案消化得到的单细胞数较低，差异有统计学意义（P＜0.01）。与B 方案消化得到的细胞存活率（91.03±0.95）%和C 方案消化得到的细胞存活率（92.43±0.51）%相比，A方案消化得到的细胞存活率（83.90±1.20）%较低，差异有统计学意义（P＜0.001）。B 方案消化得到的细胞存活率与C 方案消化得到的细胞存活率相比差异无统计学意义（P＞0.05），而与B 方案消化得到的单细胞数相比，C 方案消化得到的单细胞数较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 不同消化方案的细胞计数结果

2.3 不同消化方法的差异基因表达及功能分析 为了解不同消化方法得到的细胞基因表达水平，本研究进行了mRNA测序。通过差异基因比较分析发现，发现使用B方案消化与A方案消化对比，共有17个差异表达mRNA，其中9个基因上调，8个基因下调；使用B方案消化与使用C方案消化对比，共有20个差异表达mRNA，其中10个基因上调，10个基因下调；使用A 方案消化与使用C 方案消化对比，共有9个差异表达mRNA，其中1个基因上调，8个基因下调。通过对差异表达基因对应的信号通路分析，本研究发现使用B 方案消化得到的细胞更多的富集在类固醇合成代谢通路，说明使用B 方案消化可能获得更多的类固醇细胞，见图3。

图3 差异基因火山图，聚类分析热图及KEGG通路分析

2.4 不同消化方案的基因表达水平 肾上腺组织由多种细胞组分构成，本研究比较了3 种消化方案得到的多种细胞关键基因的转录表达水平，见图4。与使用A方案消化和C方案消化对比，类固醇细胞的相关标志基因CYP11A1，CYP17A1，CYP11B1在使用B 方案消化时表达较高，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.000 1）。与使用A 方案消化和C方案消化对比，调控皮质醇分泌的基因MC2R在使用B 方案消化时表达较高，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.000 1）。A 方案消化和B 方案消化获得的类固醇调控基因SF-1表达差异无统计学意义（P＞0.05），而与C 方案消化对比，使用B 方案消化时类固醇调控基因SF-1表达较高，差异有统计学意义（P＜0.001）。对于髓质细胞，与使用A 方案消化和C 方案消化对比，成熟的嗜铬细胞标志基因CHGA在使用B方案消化时表达相对较高，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）。然而神经干细胞标志基因NESTIN使用3 种酶消化的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，包膜细胞标志基因PTCH1和干细胞标志基因NANOG使用3种酶消化的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 不同消化方案的肾上腺细胞相对基因表达水平

2.5 流式细胞分析不同消化方案的蛋白表达水平 除了细胞关键基因的转录表达水平，本研究还通过流式细胞术分析了3种消化方案得到的细胞关键基因的蛋白表达水平，见图5。流式细胞染色结果表明，在使用B 方案消化时，CYP17A1 阳性细胞和CHGA阳性细胞均有更高的比例，各组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

图5 不同消化方案的肾上腺细胞标志基因流式染色结果

3 讨论

肾上腺位于肾脏上方，其主要由外侧的皮质和内侧的髓质组成，皮质由被膜下的球状带，中间的束状带，靠近髓质的网状带构成[7]。球状带主要产生盐皮质激素醛固酮，其主要功能是控制血流量和盐/水平衡。束状带主要产生糖皮质激素皮质醇，其不仅影响代谢，还在心血管系统，免疫系统发挥了作用。网状带主要生产脱氢表雄酮，其主要作为睾酮或雌二醇的前体，同时通过其与皮质醇的拮抗作用而对免疫系统发挥有益的作用。髓质分泌儿茶酚胺类激素（肾上腺素和去甲肾上腺素），是一类应激拟交感“斗或逃”激素[8-9]。肾上腺相关的内分泌功能紊乱可以分为机能减退紊乱（如肾上腺功能不全）和机能亢进紊乱（如高醛甾酮症，皮质醇增多症，雄激素增多症和儿茶酚胺过量）[10]。胚胎时期肾上腺的正常发育和功能对影响胎儿自身或新生儿健康也至关重要。研究报道先天性肾上腺增生患者会引起性腺功能障碍，从而影响患者的生育功能[11]。因此，研究胎儿肾上腺的内分泌功能对维持人体生理健康具有重要意义。然而，由于实验动物与人类胎儿肾上腺的内分泌功能不一致[12]，难以通过动物模型对肾上腺的内分泌功能及相关疾病进行研究。

单细胞测序技术自2009年首次问世，其发展迅速，已被证明是识别细胞亚群，发现罕见的细胞类群，追踪细胞的发育轨迹的一种强有力的工具[13]。目前，单细胞测序技术广泛应用于肿瘤研究、发育生物学、免疫学等[14-15]，为解决生物和医学问题提供了一种新的可能性。其中，单细胞测序技术的一个重要环节是单细胞悬液的制备。目前，研究报道了成人肾上腺组织使用Ⅳ型胶原酶消化后进行单细胞测序[16]。然而，对于胚胎时期肾上腺的单细胞悬液制备方法的比较，目前尚无相关文献报道，这限制了单细胞测序技术在胚胎时期肾上腺研究中的应用。因此，为了从单细胞层面对胚胎时期肾上腺组织进行深入研究，获取一种最佳的单细胞悬液制备方法十分必要。实体组织的消化方法不是单一的，组织不同消化方法不同，甚至同一组织由于实验目的不同消化方法也不同。机械打散法获得的细胞碎片较多，造成大量细胞损伤同时细胞产量也较低[17]。不同组织选取的酶消化法也是不同的，研究报道大鼠肺组织使用胰酶消化[18]，小鼠肺组织应用胶原酶Ⅴ消化[19]，人瘢痕组织采用改良联合酶消化法消化效果更佳[20]。由于肾上腺结构的复杂性，使得我们在选择消化方法时也应该考虑实验目的，所要研究的细胞不同应使用不同的消化方案。

本研究采用了机械—酶消化法，先使用剪刀剪碎组织，在采用Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶或Ⅳ型胶原酶来消化组织，并对获得的细胞形态，单细胞数量，细胞存活率及关键基因表达进行分析，以确定最佳的消化方案。与使用A 方案和B 方案消化对比，使用C 方案消化能得到较高的细胞产量[（5.41± 0.20）×105]，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），然而其细胞团块相对较多。与使用C方案消化对比，使用B方案消化得到的细胞形态完整，细胞碎片及结团少，然而其细胞产量[（3.72±0.60）×105]较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。使用B方案和C 方案消化对比，两者细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05）。

单细胞测序可以在单细胞水平上进行转录组的扩增与测序，从而解决了普通转录组不能精确到细胞类型的问题[21]。为了获取肾上腺组织单细胞悬液中细胞类型的信息，本研究对使用3 种酶消化得到的单细胞悬液通过mRNA测序，RT-qPCR和流式细胞术实验对细胞类型进行了检验。研究发现了与使用A 方案消化和C 方案消化对比，肾上腺类固醇细胞表达的基因CYP11A1，CYP17A1，CYP11B1[22]在使用B 方案消化时表达较高，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。对于髓质细胞，与使用A方案消化和C 方案消化对比，成熟的嗜铬细胞标志基因CHGA[22]在使用B 方案消化时表达较高，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。包膜细胞标志基因PTCH1[22]和干细胞标志基因NANOG[22]在使用3种胶原酶消化时表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

综上所述，与C方案消化相比，尽管B方案消化肾上腺组织所得到的单细胞悬液细胞数[（3.72 ±0.60）×105]较低，但其细胞形态完整、结团少、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净，此外，与A方案消化相比，B 方案消化所得到的单细胞悬液细胞存活率（91.03±0.95）%较高。同时，肾上腺内最主要的细胞类型（类固醇细胞和髓质细胞），与A方案和C 方案消化相比，其关键基因在使用B 方案消化时表达较高。因此，本研究认为使用B 方案消化是较优选的单细胞悬液制备方法。但是，本研究有一定的局限性，本实验仅采用了1 mg/mL的酶浓度，消化时间未作比较以及未使用联合酶消化方法，因此今后在本研究基础上进一步研究可能探索出一种更优的肾上腺组织消化方法。