余 悦，赖 坚，罗云鹏，陈美云紫，周 刚，韦丽玲，刘敬臣

（广西医科大学第一附属医院麻醉科，南宁 530021）

布比卡因作为临床常用局麻药被广泛应用于椎管内麻醉，但是研究证明其具有神经毒性，可导致围术期神经并发症[1]，一旦出现永久性神经损害，将给患者造成严重的心理和经济负担。局麻药神经毒性机制尚未明确，仍缺乏有效的防治措施，因此阐明其神经毒性机制及探讨有效调控靶点是临床急需解决的问题。本课题组前期研究发现，布比卡因通过激活NOD 样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）炎性体导致细胞焦亡从而诱导小鼠脑神经瘤细胞（Neuro-2a，N2a）毒性[2]，然而，布比卡因如何激活NLRP3 炎性体仍需进一步探索。有研究发现组织蛋白酶B（Cathepsin B,CTSB）与NLRP3 炎性体及焦亡途径密切相关[3]。CTSB 是溶酶体中重要的一种半胱氨酸蛋白水解酶，当危险因素导致溶酶体膜通透性改变时，CTSB 从溶酶体释放至细胞质，触发一系列细胞损伤通路[4]。Chen等[3]研究发现，胆固醇脑损伤细胞模型中，27-羟基胆固醇可以诱导SH-SY5Y细胞CTSB释放，导致NLRP3炎性体活化诱导细胞焦亡。而Li等[5]的研究发现布比卡因引起的肌毒性模型中自噬及溶酶体酶CTSB活性增加。CTSB是否参与布比卡因诱导的NLRP3炎性体活化导致神经细胞毒性尚未有相关报道。因此，本研究拟在布比卡因诱导的N2a 神经细胞损伤模型中，探讨CTSB 对NLRP3 炎性体活化的影响，进一步探索布比卡因神经毒性的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

小鼠脑神经瘤细胞（Neuro-2a，N2a）（中国科学院上海细胞库）；MEM 培养基和胎牛血清（美国Gibco公司）；布比卡因粉剂（美国Sigma公司）；CA-074-me（美 国MCE 公司）；CCK-8 试剂盒（日 本Dojindo公司）；乳酸脱氢酶释放检测试剂盒（中国碧云天公司）；CTSB 抗体（中国万类生物）；NLRP3 抗体、cleaved-caspase-1 抗体、N-GSDMD 抗体（美国Novus公司）；GAPDH抗体（美国proteintech公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 N2a细胞用含有10%胎牛血清的MEM完全培养基，于37 ℃、5%CO2清洁培养箱培养，每2 d 更换新鲜培养基。当细胞生长密度达80%以上，用0.25%胰酶进行消化、传代培养。将对数生长期N2a 细胞随机分为4 组，空白对照组（C组）：完全培养基培养，无任何药物干预；单纯组织蛋白酶B（CTSB）抑制剂组（CA 组）：10 μmol/L 的CA-074-me 预处理1 h 后不加任何药物处理；CTSB抑制剂预处理+布比卡因组（CA+B 组）：10 μmol/L的CA-074-me 预处理1 h 后，采用0.9 mmol/L 的布比卡因培养12 h；布比卡因组（B组）：0.9 mmol/L的布比卡因培养12 h。

1.2.2 CCK-8 法测定各组细胞活力 细胞以5×103个/孔的密度接种96孔板，按“1.2.1项”分组，每组设3个平行孔，到达药物处理时间后，用基础培养基配制10%的CCK-8 工作液，每孔更换CCK-8 工作液100 μL，避光孵育2 h。用酶标仪避光检测在450 nm波长处的吸光度（OD 值），以细胞存活率表示细胞活力。细胞存活率（%）=（各组吸光度值-空白组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%。每次实验至少重复3次，取平均值，下同。

1.2.3 LDH 释放实验检测各组细胞上清液LDH 活性 按“1.2.2项”方法培养细胞，到预定检测时间将细胞培养板用400 g 离心5 min，分别取各孔上清液120 μL，加入到新的96 孔板中，再分别加入60 μL LDH 检测工作液混匀，室温避光孵育30 min 后在490 nm处测定吸光度，吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关，根据各组细胞上清液中OD 值反映LDH活力，由此判断细胞膜损伤程度。

1.2.4 免疫荧光法检测NLPR3 蛋白表达量 细胞以2×105个/孔的密度培养于置有细胞爬片的12 孔板，分组干预。到达药物孵育时间后，PBS 润洗3 次，加入4%多聚甲醛室温下固定15 min，用0.5%Trion-X-100 通透20 min，5%山羊血清室温下封闭30 min，每孔加入NLRP3 一抗（稀释比例1∶50）150 μL 4 ℃过夜。第2天用PBS润洗3次，每孔加入荧光二抗（稀释比例1∶1 000）150 μL，室温避光孵育1 h。PBS润洗后加DAPI复染核5 min。取出爬片，倒置于加入抗荧光淬灭剂的载玻片中，于荧光显微镜下观察，以Image J 测定各组平均荧光强度，并进行半定量分析。

1.2.5 Western blotting检测CTSB、NLRP3、cleavedcaspase-1、N-GSDMD 蛋白表达 将RIPA 裂解液加入各组干预好的细胞中，冰上裂解30 min，以4 ℃，12 000 r/min 离心15 min，取上清用BCA 法进行蛋白定量。加入蛋白上样缓冲液混匀煮沸5 min 变性。每组取30 μg 蛋白在SDS-PAGE 胶上进行电泳，经湿转法将蛋白转移至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗（CTSB、NLRP3、cleaved-caspase-1、N-GSDMD，稀释比例均1∶500）和GAPDH（稀释比例1：10 000）4 ℃摇床孵育过夜；用TBST洗膜，加入荧光标记的二抗（1∶10 000），室温摇床孵育1 h，洗膜。用Image J软件测定灰度值，以目的条带与GAPDH为内参条带灰度值的比值来反映蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力的比较

与C组比较，CA组细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05），B 组和CA+B 组细胞存活率均明显降低（P＜0.05）；与B 组比较，CA+B 组细胞存活率明显升高（P＜0.05），见图1。

图1 各组细胞活力的比较

2.2 各组细胞上清液LDH活性的比较

与C组比较，CA组上清液LDH活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05），CA+B组和B组细胞LDH活性均明显增加（均P＜0.05）；与B 组比较，CA+B组LDH活性明显减少（P＜0.05），见图2。

图2 各组细胞上清液LDH活性的比较

2.3 各组细胞NLRP3蛋白免疫荧光相对表达变化

与C组比较，CA组NLRP3荧光强度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），CA+B组和B组NLRP3荧光强度均明显增强（均P＜0.05）；与B组比较，CA+B组NLRP3荧光强度明显减弱（P＜0.05），见图3。

图3 各组细胞NLRP3蛋白免疫荧光相对表达变化

2.4 各组细胞CTSB 蛋白及NLRP3 炎性体活化相关蛋白NLRP3、N-GSDMD、cleaved-caspase-1 表达情况

与C组相比，CA组CTSB、NLRP3、N-GSDMD、cleaved-caspase-1蛋白表达差异均无统计学意义（均P＞0.05），B组上述蛋白表达均明显升高（P＜0.01）；与B组比较，CA+B组以上蛋白表达均明显下调（均P＜0.05），见图4。

图4 各组细胞蛋白相对表达水平

3 讨论

布比卡因是临床常用酰胺类长效局麻药，其引起的神经毒性已成为临床麻醉医生关注的焦点。局麻药神经毒性目前尚无行之有效的防治方法，若出现早期神经损害症状，临床上常以小剂量的糖皮质激素抗炎、维生素B12营养神经、高压氧等对症支持治疗为主[6-7]。众所周知，全身应用糖皮质激素可导致消化性溃疡、血糖升高等不良反应[8]，尽管Zhong 等[9]报道局部使用地塞米松可促进神经损伤后修复，但是也有研究表明局部应用地塞米松会暂时性减少神经血流，进一步加重损伤[10]。因此，需要进一步寻找有效的防治局麻药神经毒性的调控靶点。以往研究发现布比卡因所致的神经毒性涉及多种因素及调控机制，包括氧化应激、内质网应激介导的凋亡[11]，自噬[12]，Parthanatos 等[13]程序性细胞死亡。我们前期研究发现细胞焦亡也参与其中，NLRP3 炎性体活化导致的细胞焦亡途径是布比卡因诱导N2a 细胞毒性的重要机制[2]，但是布比卡因活化NLRP3炎性体的具体机制尚未阐明。

炎性体是由模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）、含CARD 结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated Speck-like Protein Containing a CARD，ASC）和pro-caspase-1 组成的多蛋白复合体[14]。经典细胞焦亡途径的激活主要依赖于炎性体组装形成，激活pro-caspase-1 成为有活性的caspase-1，进一步切割下游GSDMD 目的蛋白，GSDMD的N末端在细胞膜上定位聚集成孔，细胞渗透压改变，逐渐肿胀至质膜破裂[15]。本研究结果显示，布比卡因处理N2a细胞12 h后，细胞活力明显下降，细胞上清液LDH 释放增多，提示布比卡因可引起N2a细胞损伤，细胞膜完整性破坏；免疫荧光结果显示，NLRP3蛋白表达显著增加，western blotting结果也显示，NLRP3 炎症体活化相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase-1和N-GSDMD显著升高，表明布比卡因可能通过激活NLRP3 炎性体及焦亡相关分子诱导N2a神经细胞毒性，与前期的研究结果一致[2]。

大量研究表明，炎性体的活化参与了多种神经系统疾病的发生发展，包括颅脑感染、创伤性脑损伤、缺血性脑卒中、神经退行性疾病等，抑制炎性体活化可减轻组织损伤[3,16-18]。Liu 等[17]的研究表明，TBI 24 h 后，NLRP3 基因敲除小鼠脑组织损伤程度和认知功能皆优于野生型（WT）组。此外，多种非神经系统疾病的发生也与NLRP3的活化密切相关，例如痛风、癌症、动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病等[18]。因此，人们对其激活机制进行广泛的研究，发现了多种激活模型，包括溶酶体不稳定[19]、活性氧的过量产生[20]、钾离子外流[21]、线粒体DNA 的释放[22]等。CTSB 是溶酶体内重要的组织蛋白酶，溶酶体受损后，溶酶体膜通透性增强，溶酶体酶包括CTSB的释放，会引起一系列细胞反应[4]。研究发现，CTSB诱导细胞凋亡，抑制人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞生长[23]。Orlowski等[24]的研究表明，由于溶酶体膜通透性改变，释放到细胞质中的CTSB 激活炎症体诱导细胞焦亡，导致原代小鼠巨噬细胞死亡。本研究发现，与对照组比较，B组布比卡因处理N2a 细胞12 h 后，CTSB 蛋白表达量显著上升，说明CTSB参与了布比卡因引起的N2a神经细胞毒性机制。为了证实CTSB 在布比卡因激活NLRP3 炎性体中的作用，本课题组应用CTSB 抑制剂CA-074-me对细胞进行预处理，抑制CTSB的活性。结果发现，与布比卡因组比较，CTSB 抑制剂预处理+布比卡因组的CTSB 蛋白表达量下调，同时细胞活性得以改善，LDH释放减少，说明CTSB抑制剂预处理减轻布比卡因对细胞损伤的作用。同时，免疫荧光结果显示NLRP3 蛋白表达减少，western blotting 结果也显示NLRP3 炎性体活化相关蛋白NLRP3、cleaved-caspase-1和N-GSDMD表达明显降低，提示CTSB 通过激活NLRP3 炎性体参与布比卡因诱导N2a神经细胞毒性机制，CTSB可能是布比卡因神经毒性机制有效的调控靶点。

综上所述，布比卡因可通过诱导Cathepsin B激活NLRP3炎性体导致N2a神经细胞毒性，为临床防治布比卡因神经毒性提供了新思路。