王守宇，陶瑞旸，侯一平，李成涛

1.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.四川大学华西基础医学与法医学院法医研究所，四川 成都 610041

在法医物证学领域，对于犯罪现场遗留的生物样本进行DNA 分析已经成为案件侦破过程中不可或缺的一个环节。然而，除确定样本来源个体外，准确识别样本来源于何种组织或体液对于犯罪现场的重建同样具有至关重要的作用。在性侵害等类型的案件中，犯罪性质的确定以及案件的调查和起诉尤其依赖这类证据。得益于各类DNA 遗传标记的广泛应用和检测技术的发展，目前以个体识别为目的的法医学检测已能够达到较为理想的效果，然而与之相比，体液类型鉴定在实际应用中仍面临很多挑战[1]。

传统的基于理化性质或细胞形态学观察的预实验以及免疫学检测虽然操作简单，但可区分的体液类型有限，并且存在种属特异性低及假阳性率高等问题[2-4]。为了提升体液鉴定的实际应用效能，包括DNA甲基化模式分析、拷贝数变异分析、微生物特征分析和RNA 表达模式分析在内的一系列新方法在过去数十年的诸多法医相关研究中被提出，并逐渐显现出替代传统方法的趋势[5-8]。在这些方法中，RNA 表达模式分析在体液斑鉴定领域尤其受到青睐，其相关应用也得到了极大的发展。由于具有组织特异性表达的特征，一些信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA）和Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）被视为十分具有应用前景的体液斑鉴定候选分子标记[9-11]。本文旨在对近年来RNA 分子标记在体液斑鉴定领域的研究进展进行归纳和总结，对已发表研究中得到有效验证的RNA 分子标记及相应的检测技术和数据分析方法进行回顾，以期为相关的法医学鉴定及研究提供借鉴。

1 RNA 分子标记种类及其在法医学体液斑鉴定领域的研究现状

1.1 mRNA 分子标记

人体由数十亿个细胞组成，根据其生理功能，各类型细胞内的mRNA 表达均在转录水平上受到特定的调控，这种差异也导致了mRNA 在特定细胞或组织中独特的表达模式[12]。作为基因表达的中间产物，mRNA 承担着重要的生理功能，虽然在总量上其仅占总RNA 的3%～5%，但是在种类上mRNA 却呈现出极大的多样性。

在法医学体液斑鉴定领域，mRNA 是最早被提出具有应用潜力并进行了广泛评估的一类分子标记。根据人类转录组学相关研究提供的不同组织转录模式信息，法医学研究者在最初的研究中筛选并检验了一些候选分子标记在各类组织或体液中的表达量[13-15]。随后，针对法医相关检材进行的mRNA 表达分析，进一步鉴定了一批在相关体液中稳定表达的分子标记[16-17]。附表1 展示了在既往研究中被证明具有较好体液鉴定效能的mRNA 分子标记及较早将其用于检测体系构建的相关研究[9，16-30]。目前，这些mRNA 分子标记的特异性和检测系统的灵敏度已在大量研究中得到广泛评估，其中包括欧洲DNA 分析组（European DNA Profiling Group，EDNAP）和法医RNA 分析组（Forensic RNA Profiling Group，FoRNAP）成员实验室开展的一系列基于毛细管电泳[27，29，31-33]和高通量测序检测[34-35]的合作研究。一些法医学实验室也基于相关研究结果构建了适用于多种体液类型推断的mRNA 复合检测体系，并将其应用于实际案件中。

为了减少样品消耗并简化工作流程，一些研究组也提出了RNA 和DNA 共同提取的方法[36-39]。共提取方法使得对同一份样本进行RNA 分析以识别体液类型的同时，也可行DNA 分析对检材来源进行个体识别。在检测效果方面，尽管有研究在一些污染或陈旧样本中成功获取了RNA 分析结果[19，40]，然而在实际案件中，许多法医物证样本的检测结果并不够理想，难以进行有效的mRNA 表达分析。这主要是因为生物检材中的mRNA 除了面临内源性降解之外，其他一些环境因素如紫外线照射、高湿度与高温环境以及微生物等也会影响其稳定性[41]。

1.2 miRNA 分子标记

miRNA 是法医学领域中另一类获得广泛研究的潜在RNA 分子标记，其在体液斑鉴定中的应用最早由HANSON等[10]提出。miRNA的长度通常为21～25个核苷酸，作为一类参与基因表达调控的非编码小RNA，其主要通过与特定序列mRNA 的3′非翻译区（3′-untranslated region，3′-UTR）结合诱导目标基因在翻译水平上的调控[42]。针对miRNA 表达谱的相关研究[43]表明，人体不同组织和细胞中miRNA 的表达情况存在一定差异。此外，目前已有近2 000 种人类miRNA序列在相关研究中被识别[44]。由于丰富的多样性以及较短的长度，miRNA 可能特别适合对污染或陈旧样本等降解程度较为严重的检材进行法医学分析[45-46]。

在体液斑鉴定方面，目前对于miRNA 分子标记最全面的研究是由SAUER 等[47]完成的。该课题组使用微阵列芯片技术检测了miRBase v18.0 中所有人类miRNA 在体液中的表达情况。去除表现出高于背景信号强度的miRNA 后，在不到20%的样品中剩下的743 个miRNA 被纳入进一步分析。随后，36 个在芯片数据中显示出不同样本间最高表达量差异的候选miRNA 分子标记被用于实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）验证。最终研究者提出了一种仅使用4 个miRNA（hsa-miR-891a-5p、hsamiR-144-3p、hsa-miR-203a-3p 和hsa-miR-124-3p）的决策算法来识别血液、精液、唾液、阴道分泌物和月经血。此外，该研究还在保存长达36年的陈旧体液斑中检测到了部分miRNA 分子标记，这一发现也进一步验证了miRNA 表达分析在降解检材中的应用潜力。

除此之外，其他一些法医学实验室也对常见体液如血液、唾液、精液、阴道分泌物和月经血中具有特异性表达的miRNA 进行了筛选和评估[48-53]，然而从目前的研究结果来看，许多miRNA 分子标记的特异性表达并非严格意义上的体液特异性，而是在一组不同类型的样本中呈现出的差异表达，这意味着其并非在目标体液之外的样本中不表达，而是在目标体液中表达量更高。尽管许多miRNA 在筛选实验中看起来很有应用潜力，但在使用RT-qPCR 等方法进行验证时却无法得到良好的结果。此外，不同研究筛选出的候选miRNA 分子标记往往并不一致，这可能是由不同的检测方法和引物设计导致的。目前，不同实验室对于最佳miRNA 分子标记及检测方法的选择，乃至如何根据检测结果解释和预测法医样本的体液类型等问题均未达成共识。

1.3 circRNA 分子标记

circRNA 是一类单链共价闭合环状非编码RNA，最早在关于类病毒、病毒和四膜虫的研究中被发现[54-56]，近几年才确定了其在人体细胞中的表达[57]。circRNA 与其编码基因在相应位置上转录产生线性RNA 共享外显子，并且通常由前体mRNA 的反向剪接形成[58-59]。由于RNA 分子的环形结构在很大程度上可以抵抗核酸外切酶的水解，circRNA 通常被认为具有较高的稳定性，而这一点也被其在细胞中较长的半衰期所证实[60]。此外，circRNA 的序列高度保守且具有组织特异性，在生物体各种细胞中大量存在，且部分circRNA 的表达水平明显超过mRNA 的表达水平[61]，因此，理论上circRNA 具有成为良好体液斑鉴定分子标记的潜质。

MEMCZAK 等[62]在针对血液样本circRNA表达情况的研究中发现了数百种容易通过RT-qPCR 检测到的circRNA 亚型，但却未发现其相应的线性基因产物，因此认为，对血液中circRNA 的表达进行分析可能会获得其他类型RNA 表达情况无法反映的疾病相关信息。而在体液斑鉴定方面，SONG 等[63]使用微阵列芯片技术检测了circRNA 在血液、唾液、精液、阴道分泌物和月经血中的表达谱，分析结果显示，不同体液中circRNA 的表达模式存在可区分的差异，但该研究未能够筛选出可用于进一步验证的分子标记；ZHANG 等[11，64-65]分别通过毛细管电泳和RT-qPCR 检测成功鉴定出与PRM2、TGM4、KLK3等14 个体液特异性mRNA 共享外显子的主要circRNA，并设计了用于同时检测线性和环状转录产物的引物组，其构建的F18plex 复合检测体系可在低至1 μL 的血液、精液、唾液，或总RNA 低至1 ng 的阴道分泌物、月经血、尿液样本中获得完整的检测结果。以上研究充分说明了将circRNA 与mRNA 表达分析相结合，可在不影响体液特异性的前提下，成为一种提升体液斑鉴定检测灵敏度和结果稳定性的有效策略。

1.4 piRNA 分子标记

piRNA 是一类非编码小RNA，其长度通常为24～32 nt，并在多种类型的细胞及外泌体中表达[66-68]。piRNA 的序列多样性较高，目前在人类基因组中鉴定出的piRNA 已超过30 000 种[69]，并且其中一些的表达具有组织差异性[70]。更为重要的是，piRNA 的3′端核苷酸上具有一个特征性的2′-O-甲基，有研究[71]表明，这种在其他大多数小RNA 中都不存在的结构有助于提升RNA 分子的稳定性。基于以上特征，piRNA 也被视为继miRNA 之后又一类具有良好体液斑鉴定潜力的小RNA 分子标记。

在法医物证学领域，WANG 等[72]首先通过RTqPCR 检测对piRNA 在体液斑鉴定中的潜在用途进行了初步探索，研究结果证实了piR-55521 的表达具有良好的精液特异性以及较高的检测灵敏度和稳定性。在此基础上，后续研究通过高通量测序揭示了piRNA在6 种类型的法医相关生物样本（静脉血、月经血、唾液、精液、阴道分泌物和皮肤）中的表达模式，并筛选出37 个在测序数据中显示出相对较高体液区分潜能的候选piRNA 分子标记。基于候选piRNA 表达矩阵的偏最小二乘-判别分析（partial least squarediscriminant analysis，PLS-DA）结果表明，在选取最佳PLS 成分数的前提下，数量精简的分子标记足以构建分类效能良好的PLS-DA 模型[73]。该研究不仅提示了piRNA 分子标记具有区分生殖细胞系相关体液与非生殖细胞系相关体液方面的优势，也充分强调了适当的数据分析方法对于小RNA 相对表达差异正确解读的重要性。

2 法医学常用的RNA 表达分析方法

2.1 毛细管电泳

毛细管电泳是检测mRNA 分子标记的常用方法之一。在检测过程中，首先需要将mRNA 逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），然后使用特异性引物对cDNA 进行终点PCR，并对扩增产物进行毛细管电泳以获得体液特异性分子标记的检测结果。毛细管电泳在体液斑鉴定方面的应用最早由BAUER等[13]提出，随后被广泛应用于多项研究中。毛细管电泳不仅可应用于mRNA 分子标记的检测，也可用于检测miRNA 和circRNA分子标记[11，74]。由于毛细管电泳检测平台被广泛应用于检测与分析法医学常用的DNA 遗传标记（如STR 和SNP），因此，相较于依靠其他平台的RNA 分子标记检测手段，毛细管电泳更易于普及。此外，通过对不同分子标记设计长度不同的扩增子，毛细管电泳方法可在同一复合扩增体系中同时检测多种分子标记，这些分子标记的目标体液既可以是单一类型，也可以是多种类型[18，20，24，75-79]。

虽然毛细管电泳方法具有上述优势，但作为一种半定量的检测手段，其在检测cDNA 时目的产物峰高与起始模板量并不存在明确的线性相关。在分析一些灵敏度较低的分子标记时，这种二元化检测结果能够提供的信息量十分有限。因此，不同实验室可能会对同样的检测结果做出不同的判读和解释。为了解决这一问题，LINDENBERGH 等[80]基于检测结果的可重复性以及观察到的峰（x）与可能存在的峰（n）之间的比例开发了一种简易的结果解读方法。当一类体液特异性分子标记在所有可能存在峰的位置上出现了至少一半的阳性检测结果（x≥n/2）时，该类型体液将被判定为“观察到”。在这种方法中，每种体液的全部mRNA 分子标记在结果判断中都具有相同的权重。而ROEDER 等[81]则提出了另一种评分方法，其根据表达特异性为每个mRNA 分子标记赋予了一个权重值，将样本中检测到的分子标记的权重值相加可得到一个体液得分。在这种方法中，仅当样本的体液得分达到一定阈值时才可对其进行体液类型判定，因此可在很大程度上降低样本类型的误判概率。

EDNAP 在2011—2015 年开展的mRNA 分子标记合作研究[27，29，31-33]也是在毛细管电泳平台上进行的。该研究集合了多个法医学实验室的检测结果，对用于血液、唾液、精液、阴道分泌物、月经血和皮肤鉴定的多种mRNA 分子标记的稳定性和可重复性进行了全面评估。研究结果表明，基于毛细管电泳技术的mRNA 表达分析可以成功地与STR 分析相结合并纳入法医学实际案件的常规处理流程中。

2.2 RT-qPCR

在涉及基因表达定量的相关研究中，RT-qPCR通常被视为金标准并广泛应用于候选基因表达量差异的确认[82-83]。正是由于RT-qPCR 定量结果的准确性，该检测方法在体液斑鉴定领域也被广泛应用于miRNA 分子标记的表达分析。根据实验目的不同，RT-qPCR 可以选择一步测定法或两步测定法进行。一步测定法在单个反应体系中结合了逆转录和PCR过程，仅能够使用序列特异性引物。而在两步测定法中，逆转录和PCR 在不同的步骤进行，因此可选择使用具有通用接头的随机引物。

目前，在法医学研究中常用的RT-qPCR 主要包括基于荧光染料检测的SYBR Green RT-qPCR 和基于荧光探针检测的TaqMan RT-qPCR，虽然在荧光染料结合方式与特异性方面存在一定差异，但两种方法本质上都是在每个循环之后通过对PCR 产物进行实时定量计算出目标基因与内参基因之间的表达量差异，即ΔCq（或ΔCt）值[23]。由于ΔCq 值可能会受到不同引物PCR 扩增效率的影响，WANG 等[84]在2012 年发表的一项研究中，通过建立扩增效率校准模型的方式为体液特异性miRNA 表达差异数据的分析提供了一种有效的方法。

在使用RT-qPCR 这类相对定量法检测目标基因的表达量时，内参基因的表达情况也会对最终的检测结果产生影响。既往研究中，普遍存在于所有类型细胞中的管家基因常被作为内参基因用于数据的标准化处理[9]。然而，近年来的多项研究[20，40，76]表明，不同管家基因在各类体液中的表达水平和稳定性也存在一定差异，因此在选择内参基因时也应当考虑样本类型可能产生的影响。针对法医常见类型的体液样本，已有多项研究[48，85-87]通过表达水平和稳定性分析对一些小RNA 内参基因的适用性进行了评估，但纳入比较的内参基因不同导致这些研究之间缺乏横向比对。在最近的一项研究中，WANG 等[88]对其进行了汇总，通过检测18 个已报道的小RNA 候选内参基因在我国汉族个体五类常见体液斑中的表达情况，最终将miR-191、miR-423、miR-93、miR-484 和let-7 确定为比较理想的内参基因。

HAAS 等[75]对基于毛细管电泳与RT-qPCR 检测得到的结果进行了比较，发现与终点PCR 结合毛细管电泳检测相比，RT-qPCR 法并没有显示出更高的灵敏度。此外，由于受到可检测荧光染料数量的限制，RT-qPCR 在单个反应体系中可进行靶向扩增的分子标记数量有限，这一缺点也使得复合检测体系的构建变得更加困难。

2.3 高通量测序

高通量测序是近年来发展十分迅速的一项应用技术。随着测序通量的不断提升以及实验成本的降低，高通量测序在法医学领域相关研究中的使用范围也在扩大，尤其是在STR 和SNP 等DNA 遗传标记的检测与分析方面显示出了良好的发展势头。迄今为止，已有数个基于高通量测序的商业化STR 和SNP 试剂盒被开发并投入实际应用[89-91]。

在体液斑鉴定领域，高通量测序的应用仍处于起步阶段。LIN 等[92]最早在其研究中对来自陈旧体液斑样本中的高度降解RNA 进行了完整的转录组学分析，实现了高通量测序技术在分析降解RNA 中的应用。在随后的一项研究中，ZUBAKOV 等[93]开发了一种基于平行靶向DNA 及RNA 测序同时分析STR 和mRNA 的方 法，成功 整合了9 个STR 遗传标记、12 个体液特异性mRNA 分子标记（可检测血液、唾液、精液、阴道分泌物、月经血和皮肤）以及2 个mRNA 内参基因。HANSON 等[26]在2018 年发表的一项研究中进一步增加了高通量测序体系中mRNA 分子标记的数量，其基于Illumina 测序平台开发的包含33 个mRNA分子标记的靶向测序体系（MiSeq/FGx 33plex）可用于血液、精液、唾液、阴道分泌物、月经血和皮肤的鉴定。根据其实验结果，这些分子标记在各自的目标体液中均显示出较高的特异性，并且与非目标体液的交叉反应极小（或无）。DØRUM 等[94]随后在包含模拟案件检材在内的183 例体液或组织样本中对MiSeq/FGx 33plex 的应用效果进行了更加全面的评估，并在数据分析过程中建立了一个预测样本类型的全新统计学模型。与传统模型相比，该模型的不同之处在于其可将测序数据中的定量信息也作为一个因子纳入分析，而不仅是基于有或无的二元化判定结果，这一提升使体液类型的预测效果得到了很大的改善。而在最近的EDNAP 合作研究[34]中，17 个成员实验室进一步评估了MiSeq/FGx 33plex 与另一个基于Ion torrent 测序平台构建的包含29 个mRNA 分子标记的靶向测序体系（PGM/S5 29plex）在体液斑鉴定中的实际使用效果。总体而言，虽然不同实验室由于测序数据量的差异导致各分子标记测序读数存在一定的差异，但是整体所反映的趋势是相同的：各类型分子标记均可在其目标体液中检测到中等或较高的读数值，而在非目标体液中的读数值很少甚至没有。此外，该研究还对数据进行了偏最小二乘（partial least square，PLS）分析，结果显示，血液、月经血、唾液和精液分子标记按样本类型呈现出良好的聚类。这项协作研究的结果再次证实了靶向mRNA 测序可作为一种可靠的方法应用到未来的体液类型鉴别相关研究中。

除了mRNA 分子标记的检测，高通量测序也被广泛应用于miRNA 分子标记的筛选和表达分析中。WANG 等[49]在2016 年发表的研究中使用Ion torrent PGM 平台检测了2 588个成熟体miRNA 在血液和唾液样本中的表达情况，并分别筛选出了6 个在血液中特异性表达、19个在唾液中特异性表达的miRNA 分子标记。随后，SEASHOLS-WILLIAMS 等[48]使用Illumina HiSeq 平台检测了miRNA 在8 种类型的法医相关生物样本（血液、精液、阴道分泌物、月经血、唾液、尿液、粪便和汗液）中的表达量，结果显示，阴道分泌物、唾液和粪便这些含菌量相对较高的体液测序数据在序列匹配与注释后获得的miRNA 读数相对较低，这可能是由于内源性细菌中的小RNA 过度饱和所导致。此外，该研究也成功鉴定出一系列体液特异性miRNA分子标记与最佳内参基因，为后续研究提供了一定参考。DØRUM 等[50]在2019 年发表的一项针对体液斑的miRNome 测序研究中，直接应用PLS 和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）根据miRNA 的整体表达模式对体液类型进行了预测。通过调整分子标记筛选阈值，评估了其建立的统计学模型在面对包含不同数量miRNA 分子标记的子集时预测准确性的差异，从而确定了足够的预测效能所需的最小分子标记数量。虽然分析结果显示，由100 个miRNA 分子标记组成的模型预测效果明显优于由9 个miRNA 分子标记组成的模型，甚至与包含全部1 034 个miRNA分子标记的模型预测效果相当，但为了减少数据分析中的变量，该研究最终仍选定由9 个miRNA 分子标记组成的预测模型并计算了其中各分子标记在对6 种生物样本（血液、唾液、精液、阴道分泌物、月经血和皮肤）的类型进行预测时的重要性指数。在某种程度上，这项研究为今后分子标记的筛选提供了新的思路，因为其分析结果提示，在体液斑鉴定模型中，能够为多种体液的区分提供有效信息的分子标记可能比仅在一种体液中具有表达特异性的分子标记更加重要。

2.4 其他方法

高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）曲线分析是在RT-qPCR 的基础上，根据单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的特征对PCR 产物进行分析的方法[95-97]。在熔解过程中，通过监测目标片段的荧光变化来获得专一的HRM 曲线和解链温度（melting temperature，Tm），根据HRM 图谱的特点来区分特异性序列的差异，具有成本低、速度快及闭管操作可避免污染等优点。基于HRM 方法，HANSON等[98]构建的mRNA 复合体系可在一定程度上区分血液、精液、唾液、阴道分泌物、月经血和皮肤样本。

基因芯片检测通过微阵列（microarray）技术将高密度DNA 片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA 探针，借助碱基互补杂交原理，根据设计芯片时的探针位置和荧光强度分布比对分析得出样本的核酸序列。基因芯片的检测准确性高、通量大，在法医学中常用于DNA、RNA 等分子标记的筛选[99-100]。

基于颜色编码的NanoString®基因定量法针对每个mRNA 标记分别设计35～50 个碱基的报告探针和捕获探针[101]，其多重检测体系可包含20～800个mRNA靶标探针对。报告探针携带信号，由与mRNA 的5′末端结合的荧光分子条形码组成；捕获探针与mRNA 的3′末端结合后，可将整个探针与mRNA 的复合体黏附在玻片表面以进行信号检测和数据收集。DANAHER等[102]应用NanoString®基因定量法对23 个mRNA 靶标进行探针杂交，用于识别血液、精液、唾液、阴道分泌液和汗液。然而，其中唾液、阴道分泌物和汗液标志物缺乏液体特异性。此外，识别体液需要的样品量较大、杂交时间冗长。

实时逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）技术由USHIO 等[103]开发，广泛用于寄生虫、疾病的快速检测和鉴定等[104-105]。RT-LAMP 通过DNA 聚合酶介导的自循环进行DNA 扩增，该酶取代目标链DNA 并在扩增时产生新的目标，因此，该过程比传统PCR 更具特异性。此外，RT-LAMP 反应速度快，仅需加热块保持在单一温度，无需专用设备。在法医学领域，SU等[106]及JACKSON 等[107]将RT-LAMP应用于血液、精液、唾液、阴道分泌液等体液中特异性mRNA 标记的检测，尽管研究结果体现出RT-LAMP 快速区分单一类型体液的能力与较高的检测灵敏度，但由于该方法对于mRNA 分子完整度要求较高，其在降解检材中的实际应用价值仍需要进一步评估。

3 展 望

经过多年的探索和发展，RNA 表达模式分析在体液斑鉴定领域已获得绝大多数实验室的认可。在实际应用中，根据现有的RNA 分子标记检测结果对样本质量较高的单一成分体液进行体液类型鉴定通常可获得较为可靠的结果，然而在面对高度降解的低质量样本或混合样本时，目前仍然没有较好的解决策略。因此，未来的研究重点也将聚焦于如何解决这两个关键问题。

鉴于小RNA 在既往针对降解程度较为严重的检材的研究中显示出较高的稳定性，未来法医学研究若能够鉴识出其他类型具有稳定化学结构的小RNA分子标记，并将其与miRNA 和piRNA 分析相结合，可能对小RNA 表达分析在体液鉴定中的整体应用效果起到很大的提升作用。而在混合样本的鉴定方面，HANSON 等[108]最早提出了将基因编码区SNP（coding region SNP，cSNP）应用于mRNA 分子标记来源个体识别的设想。作为DNA 的转录产物，RNA 分子不仅具备来自其模板DNA 序列的遗传多态性，还具有体液特异性表达的特征，若能够通过cSNP 的检测将个体识别相关的多态信息与体液类型相关的表达信息相关联，理论上可以使混合样本的鉴定效能得到质的提升。近年来，国内外一系列研究[109-114]已通过高通量测序和SNaPshot 检测等手段探索了根据cSNP 分析结果将体液类型与具有特定基因型的个体相连锁的可行性。此外，由于一些体液特异性mRNA 分子标记在部分外观和细胞成分相似的样本（如唾液和阴道分泌物）中存在交叉表达的特征，在一些案情复杂的情况下，即使对单一类型的体液样本进行溯源也可能出现检测结果的错误解读。cSNP 的相关研究亦可能为解决体液鉴定中的交叉反应提供新的实验手段。

综上，无论是新型RNA 分子标记的探索还是现有RNA 分子标记检测体系与检测方法的优化，在未来研究中均有很大的提升空间。尽管目前RNA 表达分析在体液斑鉴定和其他法医学鉴定的实践过程中仍面临一些问题，但随着有效分子标记数量的不断增加以及检测和分析方法的逐渐完善，这些问题均有望通过进一步研究得到解决，而RNA 证据也必然在法庭科学领域呈现出更高的应用价值。