刘聪 高丽洁 王淑芳 钱安平

食管癌是全球第八大常见恶性肿瘤类型，是癌症相关死亡的第六大原因，世界卫生组织癌症统计数据显示，全球食管癌年新增病例达33万例，死亡病例高达27万例[1]。我国是食管癌高发国家之一，由于该病早期缺乏典型症状、特异性症状以及有效的早期诊断方法，多数患者在确诊时往往处于中晚期，且综合治疗后5年存活率<30%[2]。因此，深入了解食管癌发生的分子学机制将为改善患者的生存现状提供重要线索。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度>200 bp的非蛋白转录本RNA，通过表观遗传学修饰、转录调节、miRNA调控等多种方式参与包括细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成和放化疗抵抗等在内的癌症各个生物学过程[3-5]。lncRNA同源盒基因C13反义RNA(HOXC13-AS)位于12q13.13，乳腺癌、鼻咽癌中HOXC13-AS表达增加，对肿瘤发生发展起促进作用[6,7]。然而，HOXC13-AS在HOXC13-AS在食管癌中的生物学作用和潜在机制尚不清楚。本研究通过检测食管癌组织中HOXC13-AS的水平，探讨干扰HOXC13-AS表达对食管癌细胞Eca-109增殖和凋亡影响，分析其下游靶miRNA，以期为食管癌治疗提供有效靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂:Eca-109细胞购自中国科学院上海细胞研究所；逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix购于大连宝生物公司；小干扰RNA(si-RNA)及其阴性对照(si-NC)、miRNA抑制物(anti-miR-204-5p)及其阴性对照(anti-miR-NC)购自上海生工公司；膜联蛋白V(Annexin-V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司；兔源磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、半胱氨酸蛋白酶3前体(pro-caspase3)、裂解的caspase3(Cleaved-caspase3)、羊抗兔IgG抗体购于上海艾博抗生物公司

1.1.2 组织来源:选取2017年1月至2018年1月于我院进行确诊和手术切除的31例食管癌组织标本及其癌旁组织标本。患者术前均未接受化疗或放疗，无合并其他肿瘤；其中男19例，女12例。患者均签署知情同意书，符合医学伦理学规定。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:Eca-109细胞采用补充10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的RPMI-1640培养基在CO2体积分数为5%的37℃恒温细胞培养箱中培养。细胞80%汇合时采用胰蛋白酶消化为单细胞，按照1∶3比例转移至新的平皿中，每隔2 d换液1次。

1.2.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测HOXC13-AS和miR-204-5p表达:Trizol法提取总RNA后，逆转录试剂盒合成cDNA利用SYBR Green PCR Master Mix进行RT-qPCR反应。GAPDH、U6分别作为检测HOXC13-AS和miR-204-5p表达的内源性对照，2-ΔΔCT法计算HOXC13-AS和miR-204-5p相对表达量。HOXC13-AS上游引物5’-CCTCA AGAAGACCAGCCGAAGTTG-3’，下游引物5’-ATTGTTCAGAGCAAGCGGACTTCC-3’；GAPDH上游引物5’-CGAGGTCATAGTTCCTGTTGGTG-3’，下游引物CCCAATACGACCAA ATCCGTT；miR-204-5p上游引物5’-CGAAGTTCCCTTTGTCATCCT-3’，下游引物5’-GTGC AGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCG-3’。

1.2.3 细胞转染和实验分组:将对数期Eca-109细胞接种6孔板，按照Lipofectamine 3000说明书将si-NC、si-HOXC13-AS、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC、si-HOXC13-AS+anti-miR-204-5p分别转染50%融合的Eca-109细胞，依次记为si-NC组、si-HOXC13-AS组、si-HOXC13-AS+anti-miR-NC组、si-HOXC13-AS+ anti-miR-204-5p组。随后将细胞用含10%胎牛血清的培养基孵育48 h，收获细胞RT-qPCR检测转染效率合格后进行后续实验。

1.2.4 集落形成实验检测克隆形成数:将各组细胞接种直径60 mm培养皿中，置于培养箱中培养，当在培养皿中可见细胞集落时(约14 d)，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，4%多聚甲醛、0.1%结晶紫分别进行固定和染色。显微镜下计数>50个细胞的集落数。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布:①凋亡检测：每组取1×105个细胞悬浮在500 μl结合缓冲液中，加入5 μl的Annexin-V-FITC暗室孵育15 min。随后再加入5 μl的PI染液，暗室孵育15 min。1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡。②周期检测：-20℃条件下用70%乙醇固定各组细胞12 h，在核糖核酸酶A存在情况下，加入PI室温染色30 min。通过流式细胞术分析各时相细胞比例。

1.2.6 免疫印迹法(Western blot)检测Cleaved-caspase3和pro-caspase3蛋白表达:使用放射免疫沉淀蛋白提取试剂裂解各组细胞获得细胞蛋白。取等量蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行湿法转膜。将膜置于5%脱脂牛奶缓冲液中室温封闭1 h，然后孵育含pro-caspase3、Cleaved-caspase3抗体4℃过夜。GAPDH抗体作为对照。用山羊抗兔IgG抗体室温孵育2 h后进行化学发光显色。Image J软件分析目的条带灰度值。

2 结果

2.1 HOXC13-AS在食管癌组织中的表达 食管癌组织中HOXC13-AS的表达水平较癌旁组织显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 HOXC13-AS在食管癌组织中的表达

2.2 干扰HOXC13-AS对Eca-109增殖的影响 si-HOXC13-AS组Eca-109细胞克隆形成数、S期细胞比例较si-NC组显著降低(P<0.05)，G0～G1期细胞比例较si-NC组显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 干扰HOXC13-AS对Eca-109的影响

2.3 干扰HOXC13-AS对Eca-109凋亡的影响 si-HOXC13-AS组Eca-109细胞HOXC13-AS表达水平较si-NC组显著降低(P<0.05)，提示转染si-HOXC13-AS后Eca-109细胞HOXC13-AS表达受到抑制。si-HOXC13-AS组Eca-109细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、miR-204-5p表达较si-NC组显著升高(P<0.05)，pro-caspase3蛋白表达较si-NC组显著降低(P<0.05)。见表3，图1。

表3 干扰HOXC13-AS对Eca-109凋亡及Caspase3蛋白表达的影响

图1 干扰HOXC13-AS对Eca-109凋亡及Caspase3蛋白表达的影响

2.4 HOXC13-AS靶向miR-204-5p HOXC13-AS序列中含有与miR-204-5p互补结合的位点。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-204-5p mimics和WT-HOXC13-AS共转染后细胞荧光素酶活性较miR-NC和WT-HOXC13-AS共转染显著降低(P<0.05)；而miR-204-5p mimics和MUT-HOXC13-AS共转染后细胞荧光素酶活性与miR-NC和MUT-HOXC13-AS共转染比较无显著变化。见表4，图2。

表4 双荧光素酶报告实验验证HOXC13-AS和miR-204-5p的靶向关系

图2 HOXC13-AS靶向miR-204-5p

2.5 干扰miR-204-5p和HOXC13-AS对Eca-109增殖凋亡的影响 si-HOXC13-AS+anti-miR-204-5p组Eca-109细胞miR-204-5p表达、细胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、G0-G1期细胞比例较si-HOXC13-AS+anti-miR-NC组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，克隆形成数、S期细胞比例、pro-caspase3蛋白表达较si-HOXC13-AS+anti-miR-NC组显著升高(P<0.05)。见图3，表5、6。

图3 干扰miR-204-5p和HOXC13-AS对Eca-109凋亡及Caspase3蛋白表达的影响

表5 干扰miR-204-5p和HOXC13-AS对Eca-109增殖的影响

表6 干扰miR-204-5p和HOXC13-AS对Eca-109凋亡的影响

3 讨论

食管癌是一种常见消化道恶性肿瘤，具有发病率高、复发转移率高等特点，是全球人类癌症相关死亡的重要原因。目前，食管癌发生发展分子机制尚不完全清楚，本研究旨在揭示HOXC13-AS在食管癌进展中的作用。

研究显示，肝癌组织中HOXC13-AS表达高表达，其水平升高与临床病理分期、淋巴结转移有关，且HOXC13-AS高表达肝癌患者的总生存期明显缩短[8]。乳腺癌中HOXC13-AS高表达显著促进乳腺癌细胞的增殖和肿瘤生长。胶质瘤中干扰HOXC13-AS表达显著抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化(EMT)过程[9]。此外，HOXC13-AS高表达在头颈部鳞状细胞癌中具有诊断生物标志物作用[10]。

本研究探讨HOXC13-AS在食管癌发生发展中的作用发现，食管癌组织中HOXC13-AS表达较癌旁组织显著升高。转染si-HOXC13-AS进行体外实验显示，干扰HOXC13-AS表达显著抑制食管癌细胞Eca-109克隆形成，诱导细胞周期G0-G1期阻滞和凋亡。细胞凋亡是由一系列特定的死亡诱导信号启动，而caspase-3激活是凋亡发生的重要途径。本研究中，干扰HOXC13-AS表达后Cleaved-caspase3蛋白水平显著升高，pro-caspase3蛋白水平显著降低，与干扰HOXC13-AS表达的促凋亡作用一致。以上研究证实，干扰HOXC13-AS表达在食管癌中具有抗增殖和促凋亡作用。

越来越多的研究表明，lncRNA通过与miRNA结合，从而影响和调节miRNA功能在癌症的发生和发展中起着重要作用[11,12]。目前，关于lncRNA在食管癌进展中的作用也多与调控miRNA表达有关。例如，下调lncRNA PVT1通过促进miR-145表达，从而抑制食管癌细胞迁移和侵袭，促进细胞凋亡[13]。lncRNA CCAT1通过靶向miR-143促进食道癌细胞的增殖和顺铂耐药[14]。

本研究通过序列分析发现，HOXC13-AS与miR-204-5p存在互不补结合位点，并通过双荧光素酶实验和RT-qPCR证实HOXC13-AS靶向miR-204-5p并负调控miR-204-5p表达。已有研究显示，食管癌组织中miR-204-5p表达显著降低，过表达miR-204-5p显著抑制食管癌细胞增殖、迁移侵袭和EMT，并促进其凋亡[15-18]。为进一步证实HOXC13-AS是通过调控miR-204-5p表达在食管癌中发挥抗肿瘤作用，本研究将si-HOXC13-AS和anti-miR-204-5p同时转染Eca-109细胞，结果显示抑制miR-204-5p表达显著降低干扰HOXC13-AS表达对Eca-109细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，降低对pro-caspase3和Cleaved-caspase3蛋白表达的影响，这进一步证实干扰HOXC13-AS表达至少部分通过负调控miR-204-5p来抑制Eca-109细胞增殖，诱导细胞凋亡。

综上所述，食管癌中HOXC13-AS表达增加，干扰HOXC13-AS表达通过负调控miR-204-5p能够抑制食管癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，是食管癌的潜在治疗靶点。