徐秀珍，曾运航，田永强，周建飞，李霞，石碧,＊

（1. 四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065；2. 四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川 成都 610065）

前言

由于受屠宰场与制革企业之间的距离限制，鲜皮在进入制革工厂加工前，通常需要进行防腐处理，以保证其在运输及保存过程中不会腐烂[1]。原皮的保藏方法通常包括NaCl 腌制法[2]、KCl 腌制法[3]、季铵盐腌制法[4]、真空保藏法[5]、低温冷冻保存法[6]等。在这些方法中，NaCl 腌制法因具有操作简便、成本低廉、抑菌效果优异等特点，是目前应用最广泛的保藏方法。高浓度的NaCl 能使鲜皮脱水，使细菌在鲜皮中难以存活，同时抑制蛋白酶对皮的水解活性[7]。然而，某些耐盐菌和嗜盐菌可以在高盐环境中生存[8-11]，并在NaCl 腌制过程中损伤原皮[12-14]。盐腌皮表面上出现的红色菌斑，即通常所说的“红热”，就是嗜盐细菌造成的一种典型损伤[15]。

大量研究表明，盐腌皮中存在具有水解蛋白质和脂质能力的耐盐菌及嗜盐菌[16-18]。Birbir 等[19]从用于腌制鲜皮的盐矿中分离出了56 株极端嗜盐菌。Caglayan 等[20]在盐腌皮上也发现了大量嗜盐细菌。研究盐腌皮上细菌群落的生长、变化和演替等信息，对提高盐腌皮的质量、探索少盐甚至无盐原料皮保藏技术至关重要。但是有关盐腌皮上细菌的大多数基本生物学信息，例如物种组成、丰度、种群结构、功能预测和系统进化等尚不明确。

高通量测序已成为生物学研究中非常重要的工具[21]，因为它不需要分离纯化微生物，可直接对混合微生物中提取的DNA 开展生物信息学分析，所以常用于筛选肿瘤的基因突变[22]，预测遗传病风险[23]，选育高产农作物[24]，以及分析特定环境的微生物[25]。本文采用高通量测序技术和生物信息学工具，研究了鲜皮和盐腌皮上细菌的种类、丰度和功能预测，以期为更好地设计NaCl 腌制方法提供生物学依据，也为有针对性地开发更环保的原皮保藏方法提供指导。

1 实验部分

1.1 主要材料和试剂

鲜牛皮，成都市青羊区世纪皮草部；氯化钠，工业级（≥99.1%），顺城盐品股份有限公司；DNA 提取试剂盒（型号D3142）及PCR 扩增试剂盒，广州美吉生物科技有限公司。

1.2 鲜皮的腌制

分别用0%，10.8%，21.6%和43.2% NaCl（以鲜皮的质量计），在转鼓中腌制四张去肉后的鲜牛皮，液比0.5，转60 min，停30 min，重复3 次。取出牛皮置于阴凉通风处。在保存0、1、3 和5 d 后，在牛皮上采样分析皮中的NaCl 含量、皮的表面形态、组织学特征以及细菌信息学。由于本实验的样品量远少于工厂的实际生产量，皮在存放过程中受到环境的影响大，更易观察到腐败情况，因此在1、3、5 d 取样分析。

1.3 皮中NaCl 含量的测定

用Volhard 法测定皮中的NaCl 含量[26-27]。将约1 g 绝干皮样放入250 mL 的碘量瓶中，加入105 mL硝酸溶液（10%），密封，静置24h。24h后，将未消解完全的样品加热煮沸，直至皮样完全消解。将50 mL 消解液与50 mL 硝酸银溶液（0.1 mol/L）混合，并煮沸至沉淀絮凝、上清液澄清。冷却后，依次向上述混合物中加入10 mL 苯甲醇和1 mL 铁铵明矾指示剂。用0.1 mol/L 硫氰酸铵溶液滴定混合物，至出现砖红色沉淀。按照公式（1）计算鲜皮的NaCl 含量：

CNaCl——皮样中NaCl 的含量，g/g；

V1——硝酸银溶液的体积，L；

c1——硝酸银的浓度，mol/L；

V2——硫氰酸铵的体积，L；

c2——硫氰酸铵的浓度，mol/L；

m——绝干皮样的质量，g。

1.4 组织学观察

将1 cm ×1 cm 的皮样置于10 中性甲醛溶液中固定48 h。自来水流水冲洗后，用冷冻切片机（CM1950，徕卡，德国）切取厚度为15 μm 的纵切面切片。在室温下干燥24 h 后，将切片用苏木素和伊红染色（HE 染色）[29]。用生物显微镜（DMi8，徕卡，德国）观察染色的切片，以鉴定牛皮上表皮、毛囊和胶原纤维的完整性。

1.5 DNA 提取和PCR 扩增

首先用800 mL 无菌蒸馏水洗涤10 cm × 10 cm 的皮样。用无菌纱布过滤洗涤后的水以除去牛毛等杂质，之后将滤液静置10 min。取40 mL 下层菌悬液以10 000 r/min 离心10 min 以得到菌体。用DNA 提取试剂盒提取菌体的DNA。采用PCR 法扩增16S rDNA 的V3-V4 区段序列[29]。PCR 总体积50 μL，其中包含5 μL 的dNTP 溶液（2 mmol/L），3 μL的MgSO4溶液（25 mmol/L），5 μL 的10×KOD 缓冲液，1 μL 的KOD 聚合酶，1.5 μL 的341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'） 引物，1.5 μL 的806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTA-AT-3'）引物，以及100 ng 模板DNA[29]。PCR 扩增及测序工作由广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.6 测序数据分析

首先对扩增得到的16S rDNA 序列进行筛选，然后用FLASH 软件对V3-V4 区段序列进行拼接，去除引物后进行低质量过滤。接着用USEARCH 软件进行聚类并去除嵌合体以后获得有效序列，再用UPARSE 算法将有效序列聚类为操作分类单元（operational taxonomic units,OTUs）[29]。通过聚类操作，对相似度大于97%的所有序列进行OTU 划分。最后，用QIIME 软件计算样品的Chao1 指数、Shannon 指数[31]。

在核糖体数据库项目（RDP）中，基于SILAB[32]、Greengene[33]、UNITE[34]和ITS2[35]等数据库，采用朴素贝叶斯模型将代表性序列归类到细菌菌属[36]。置信度阈值范围为0.81。接着进行可视化丰度统计，细菌分类学鉴定，绘制物种丰富度热图。最后，用Tax4Fun 和PICRUSt 进行KEGG 代谢功能预测[37]，用FAPROTAX 数据库及相关软件分析细菌的生态功能[38]。采用Welch’s t 检验、Wilcoxon 秩次检验、Kruskal-Wallis H 检验和Tukey’s HSD 法计算组间函数差异[15]。

2 结果与讨论

2.1 皮中氯化钠含量对防腐效果的影响

本研究的目的之一是分析盐腌皮上细菌群落的变化。因此，我们首先用不同用量的NaCl 腌制鲜皮，得到NaCl 含量不同的皮样。如图1 所示，盐腌皮中的NaCl 含量随着腌制时NaCl 用量的增加而增加。未经NaCl 腌制的皮中NaCl 含量约2.2%，这些NaCl 可能来自鲜皮中的含氯物质。用10.8%、21.6%和43.2% NaCl 腌制的皮中分别含有7.5%、9.1%和17.8%的NaCl（此处NaCl 含量为保存1、3、5d 皮样中NaCl 含量的平均值）。随着保存时间的延长，用21.6%和43.2%NaCl 腌制的皮中NaCl 的含量略有下降，这应该是因为随着皮中水分的蒸发，部分NaCl 形成结晶并从皮上掉落。

图1 不同用量NaCl 腌制皮中的NaCl 含量

盐腌皮的表面形态和组织学特征可以反映其变质情况。由图2 和图3 可知，在不用NaCl 腌制的情况下，鲜皮保存1 d 后，表皮和毛囊就开始脱落，3 d 内就被蛆（图中的白色斑点）和细菌严重破坏，5 d后被大量分解。当用10.8%NaCl 腌制时，保存3 d后，在皮面也观察到一些蛆，皮的表皮层出现较大程度的分离。当NaCl 用量增至21.6%和43.2%时，皮的表皮、毛囊、胶原纤维等在保存五天后均完好无损。上述结果表明蛆和细菌的生长与皮中的NaCl含量密切相关，增加腌制时NaCl 的用量有助于鲜皮的防腐。

图2 不同用量NaCl 腌制皮样的表面形貌

图3 不同用量NaCl 腌制皮样的纵截面的HE 染色图（标尺500 μm）

2.2 16S rDNA 基因分析概述

对来自工业级NaCl、鲜皮和盐腌皮上细菌的16S rDNA 基因进行分析，以更好地识别盐腌皮上的细菌种类及来源。图4a 和4b 分别给出来自NaCl、鲜皮和盐腌皮上细菌的Shannon 指数和Chao1 指数。每组的Shannon 指数稀释曲线最终趋于水平，表明测序深度足够（图4a）。在所有样品中，NaCl 中细菌的Chao1 指数最低，说明NaCl 中细菌的丰度明显低于皮样上的细菌丰度（图4b）。鲜皮上细菌的Chao1 指数高达2300，这表明鲜皮上的细菌种类多，有效抑制细菌是鲜皮良好防腐所必需的。未经NaCl 腌制的皮样上细菌的Chao1 指数随着时间的延长明显下降，这主要是因为蛆和细菌迅速消耗了鲜皮中的营养物质（蛋白质和脂质），而且可能含有蛋白水解活性的细菌快速生长成为优势物种，抑制了其他细菌的生长，因此细菌多样性下降，这说明NaCl 具有一定的抑菌作用。10.8%和21.6%NaCl 腌制的皮样上细菌的Chao1 指数随着保存时间的增加波动较小，说明细菌丰度较为稳定。保存三天后，43.2% NaCl 腌制的皮样上细菌的Chao1 指数增至2557，远高于保存一天的样品。产生此结果的原因可能是，高盐环境虽然不利于大部分细菌的生长，但是激活了少量嗜盐菌的生长，总体上细菌的Chao1 指数增加。

图4 Alpha 多样性分析（a）NaCl、鲜皮和盐腌皮上细菌的Shannon 指数。Dx-y%表示通过y% NaCl 腌制并保存x 天的皮样。（b）NaCl、鲜皮和盐腌皮上细菌的Chao1 指数。Day 1、Day 3、和Day 5 代表盐腌皮分别保存了1、3 和5 天。（b-1）保存一天后，除毛发外，鲜皮中大部分的蛋白质和脂类被蛆和细菌消耗。（b-2）保存三天后，用43.2% NaCl腌制的皮在肉面出现了一些细菌菌落

图5中的维恩图分析展示了NaCl、鲜皮以及盐腌皮中细菌种类之间的关系。用0%、10.8%、21.6%和43.2%NaCl 腌制的皮在保存一天后，皮上细菌的OTUs 数量分别为1704、1592、1354 和1127。NaCl和鲜皮之间的共有OTUs 数量均小于100，而盐腌皮和鲜皮之间的共有OTUs 数量大于600。这些结果表明，盐腌皮上的细菌与鲜皮上的细菌更接近，由此可见盐腌皮上的细菌主要来自于鲜皮。

图5 NaCl、鲜皮和盐腌皮（保存一天）上细菌OTUs 的维恩图维恩图的重叠部分是相应样本的共有OTUs，非重叠部分代表样品的特有OTUs

2.3 细菌的相对丰度

将所有的有效OTUs 与微生物的参考数据库进行比较，以获取NaCl、鲜皮和盐腌皮上细菌在属水平上的相应分类信息。所有样品中丰度均值排名前10 的菌属如下：Vibrio、Psychrobacter、Halomonas、Staphylococcus、 Corynebacterium、 Acinetobacter、Wohlfahrtiimonas、 Jeotgalicoccus、 Comamonas 和Tissierella（图6）。在NaCl 中，大量细菌是未知的或尚未进行分类的。Vibrio 在鲜皮以及保存一天的未腌制和21.6%NaCl 腌制的皮上最丰富。在未腌制、10.8%NaCl 腌制和21.6%NaCl 腌制的皮上，Vibrio的丰度随着保存时间的增加显著降低；而在43.2%NaCl 腌制的皮中，Vibrio 的丰度在保存三天后有所增加。出现此结果的原因，一方面可能是保存一天的皮中其他菌属（Other）占比过大，导致Vibrio 的相对丰度更低；另一方面可能是Vibrio 的生长需要Na+刺激[39]，43.2%NaCl 更有利于其生长，所以Vibrio 的相对丰度在保存三天的皮中增大。Staphylococcus 在大多数皮样中都有出现，在10.8%NaCl 腌制并保存一天的皮中Staphylococcus 的相对丰度很高，这正是10.8%NaCl 腌制皮中Vibrio 的相对丰度较 低 的 原 因 。 Psychrobacter、Halomonas 和Corynebacterium 主要存在于盐腌皮上，据报道Psychrobacter 和Halomonas 是嗜盐菌[40-41]。Acinetobacter仅存在于NaCl 和43.2% NaCl 腌制的皮上，可见Acinetobacter 是嗜盐菌，需要高盐环境才能生存。上述结果表明，NaCl 腌制法不能有效抑制所有细菌，尤 其 Vibrio、Psychrobacter、Halomonas、Staphylococcus 和Corynebacterium 均难以被抑制。总体而言，NaCl、鲜皮和盐腌皮上细菌的种类存在显著差异。鲜皮中的一些耐盐菌可以在低含量的NaCl 中生长并使原皮腐烂，并且某些耐盐细菌或嗜盐细菌盐腌皮上可能生长成为优势物种。这些结果同时证明了，NaCl 极大地改变了鲜皮上的细菌群落结构。

图6 NaCl、鲜皮和盐腌皮上丰度均值排名前10 的细菌（属水平）的相对丰度Dx-y%表示通过y%NaCl 腌制并保存x 天的皮样

2.4 细菌群落的功能预测

图7是基于16S rDNA 序列，以Silva 数据库为参考数据库，用Tax4Fun 预测的细菌群落的功能。与细菌的生长密切相关的碳水化合物代谢、膜转运、核苷酸代谢、翻译以及复制和修复等，随着NaCl用量的增加而降低。这表明NaCl 腌制是一种有效的保藏方法。上述基础代谢的速率在10.8%NaCl 腌制并保存一天的皮样中最高，说明此时细菌生长得最快。细菌的脂质代谢、外源性物质的降解与代谢、萜类和聚酮类化合物的代谢、其他次生代谢物的合成等次级代谢的速率，随着保存时间的增加而增大，这可能是因为耐盐菌或嗜盐菌的次级代谢活性增强。这些结果证明了，NaCl 是通过抑制细菌的基础代谢，而不是次级代谢，来达到其抑菌效果的。

图7 NaCl、鲜皮和盐腌皮上细菌群落的功能预测Dx-y%表示通过y% NaCl 腌制并保存x 天的皮

2.5 环境因素分析

冗余分析是一种可以用线性模型直接反映细菌、样品和环境因素之间相互关系的梯度分析技术。如图8 所示，保存时间和NaCl 用量都会影响盐腌皮中细菌的相对丰度。此外，RDA 分析可知，保存时间和NaCl 用量分别占环境因素的22.4%和9.3%，这表明保存时间对细菌丰度的影响更大。保存三天以上的皮样上细菌丰度与保存时间呈正相关，这说明随着保存时间的延长，皮样上的细菌丰度增加。因此，即使是经过NaCl 腌制处理的原皮，仍然不能保证不受细菌的侵蚀。Vibrio、Staphylococcus 和Wohlfahrtiimonas 的丰度与NaCl 用量呈负相关，而Halomonas、Corynebacterium 和Acinetobacter 的丰度与NaCl 用量呈正相关，这表明NaCl 可以有 效 抑 制 Vibrio、Staphylococcus 和 Wohlfahrtiimonas，而对Halomonas、Corynebacterium 和Acinetobacter 的抑制效果不足。因此，对盐腌皮应重点关注Halomonas、Corynebacterium 和Acinetobacter 的生长情况，且用针对性强的抑菌剂或杀菌剂进一步处理盐腌皮，应该有助于提升原皮保藏的品质。

图8 环境因素分析NaCl、鲜皮和盐腌皮上细菌群落结构与保存时间和NaCl 用量的冗余分析Dx-y%表示通过y%NaCl 腌制并保存x 天的皮样

3 结论

盐腌皮的保藏效果随着NaCl 用量的增加而提高，但细菌分布表明也并非NaCl 用量越高越好，而是适量的NaCl 对鲜皮的腌制效果更好。NaCl 极大地改变了鲜皮上的细菌群落。工业级NaCl、鲜皮和盐腌皮上丰度均值排名前10 的菌属为：Vibrio、Psychrobacter、Halomonas、Staphylococcus、Corynebacterium、Acinetobacter、Wohlfahrtiimonas、Jeotgalicoccus、Comamonas 和Tissierella。盐腌皮上的细菌主要来自鲜皮，除Vibrio、Psychrobacter、Halomonas、Staphylococcus 和Corynebacterium 外，大多数的细菌都能被NaCl 抑制。NaCl 具有抑菌活性的原因是它可以抑制鲜皮上细菌的基础代谢。但是，在盐腌皮上存在一些很难被抑制的嗜盐菌和耐盐菌，如Psychrobacter 和Halomonas。与NaCl 的用量相比，保存时间对鲜皮上细菌丰度的影响更大。综上所述，采用适当的方法抑制盐腌皮上的嗜盐菌和耐盐菌并缩短盐腌皮的保存时间是提高盐腌皮质量的关键。