周 静， 王蕊蕊， 丁芷柔， 胡 平， 郭春晖， 彭 欣， 王瀚棠， 杨振德

广西大学林学院，广西 南宁530004

桉树枝瘿姬小蜂LeptocybeinvasaFisher & La Salle，隶属膜翅目Hymenoptera姬小蜂科Eulophidae，2000年首次发现于中东和地中海地区，主要在桉属植物的幼嫩部位(嫩枝、叶柄及叶片主脉)产卵形成虫瘿，导致叶片变形，严重时甚至影响桉树的光合作用和营养运输(Mendeletal.,2004)。2007年，我国在与越南交界的东兴市首次发现该害虫(吴耀军等,2009)，该虫危害范围广、传播迅速，自入侵我国后，分布于广西、广东、海南、江西和云南等省(自治区)(寇冀蒙等,2020)，高度适生区包括海南、广西、广东3个省(区)全范围及四川、贵州、浙江等省的大部分地区(黄梦伊等,2020)，严重影响我国桉树产业的发展。

昆虫体内拥有丰富的细菌、真菌和酵母等微生物类型，细菌可为宿主昆虫提供营养物质，合成昆虫所必需的氨基酸、维生素等化合物(钟勇等,2020； Douglas,2015; Luetal.,2016)。共生微生物主要定殖于昆虫的体表、肠道和细胞内，为昆虫提供营养物质的同时影响昆虫的生长发育与行为，甚至提高宿主的防御与解毒功能，协助其入侵(张焱等,2016; 张振宇等,2017； Luetal.,2016)。

目前，对桉树枝瘿姬小蜂的研究局限于生物学特性(Udagedaraetal.,2014; Vanegas-Ricoetal.,2015)、天敌(冯梦霞等,2016; Benjakhun & Kosol,2019; Bushetal.,2018)及环境对其产生的影响(陈元生等,2020)等方面。据报道,其伴生细菌能够降解桉树次级代谢物质、促进入侵进程(寇冀蒙等,2020)。Guoetal., (2020)、王蕊蕊等(2018,2019)探讨了不同性别和季节对桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内细菌多样性的影响，但不同寄主植物对该虫体内细菌多样性的影响尚未见报道。本研究利用高通量测序技术对2种不同寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌种类及多样性进行了研究，旨在阐明桉树枝瘿姬小蜂体内细菌在寄主适应中的作用，为通过干扰虫体内微生物群落多样性及平衡状态进行桉树枝瘿姬小蜂的微生态防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 供试材料

桉树枝瘿姬小蜂分别采自广西大学林学院校内教学实践基地网室中隔离种植的2种2年生桉树，即巨园桉(Eucalyptusgrandis×Eucalyptustereticornis)DH201-2和窿缘桉(Eucalyptusexserta)。2018年7月分别采集每种桉树上刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫。

1.2 样品总DNA的提取及细菌16S rRNA基因扩增和测序

参考Guoetal.(2020)的方法分别将采集的刚羽化健康的桉树枝瘿姬小蜂在无菌条件下，用无菌水清洗3次，再用75 % 酒精浸泡1 min后用无菌水清洗，最后用1‰ HgCl2浸泡3 min，并用无菌水清洗5～6次，按照Power Soil®DNA Isolation kit 说明书提取各样品总DNA，提取的DNA放入-80 ℃冰箱内保存，每个样品50头雌成虫。将冻存的所有DNA样品送至北京百迈客生物科技有限公司，应用Illumina HiSeq 2500平台进行高通量测序。利用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增V3+V4区间片段。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行15个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保温。PCR反应体系：DNA模板60 ng，338F (10 μmol·L-1)1.5 μL，806R (10 μmol·L-1)1.5 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL，High GC Enhancer10 μL，Buffer 10 μL，dNTP1 μL，ddH2O补足至总体积50 μL。

1.3 测序数据分析

使用FLASH v 1.2.11软件对每个样品的reads进行PE reads拼接，再使用Trimmomatic v 0.33软件过滤，最后利用UCHIME v 4.2软件得到有效序列。统计各阶段的序列数、有效率等参数来评估数据质量。使用QIIME v 1.8.0软件在97%相似度水平下进行聚类，统计各样品中含有的OTU (operational taxonomic units)数目，以及每个OTU中含有序列的数目。在97%相似度水平下，使用Mothur v 1.30软件(http:∥www.mothur.org/)计算菌群丰富度指数(Chao1值、Ace值)、多样性指数(Shannon指数和Simpson指数)及OTU覆盖率，进行Alpha多样性分析。使用Mothur v 1.30软件与SILVA数据库(http:∥www.arb-silva.de/)PyNAST算法和RDP Classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行序列比对及物种注释得到对应的物种分类信息，制作物种丰度表和群落结构图。

2 结果与分析

2.1 测序序列数据统计及质量评估

分别对以巨园桉DH201-2和窿缘桉为寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌16S rDNA V3+V4区进行Illumina HiSeq 2500测序，分别获得169818、146284对PE Reads；双端Reads拼接后获得162586、138694条原始序列；经过滤优化后获得147688、125773条Clean tags，有效率分别为86.8%、85.75%，均高于85%。去除嵌合体后2个寄主样品有效序列的平均长度406、409 bp，均大于400 bp，Q20值96.28%、96.21%，均大于95%，Q30值93.05%、92.89%，大于90%，说明在PCR过程中2个寄主样品产生的嵌合体较少，且每个寄主样品测序的准确度均较高。

2.2 OTU分析

以97%的一致性将2组样品的有效序列进行聚类分析(图1)，共鉴定出230个细菌OTUs，其中取食巨园桉DH201-2、窿缘桉的桉树枝瘿姬小蜂内生细菌物种的OTU数分别为206和171个，2组样品共有OTU数为147，占总OTU数的63.91%，分别占寄主样品总OTUs的71.36%(巨园桉DH201-2)、85.96%(窿缘桉)，表明以巨园桉DH201-2为寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内的细菌种类更多。

图1 不同寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌群落OTUs的Venn图Fig.1 Venn profile of bacterial OTUs in L. invasa with different host

2.3 Alpha多样性分析

Alpha多样性主要与群落丰富度和多样性2个因素有关。在97%相似度分类水平上，计算Alpha多样性指数。通过QIIME(v.1.8.0)计算OTU的Goods_coverage指数均为100%，说明各样品文库覆盖率好，反映了样本的真实情况。其中,取食巨园桉DH201-2的虫体细菌ACE指数(207.2380)和Chao1指数(212.0)均高于取食窿缘桉寄主的虫体细菌样品(分别为172.5012、173.0)，说明取食巨园桉DH201-2的虫体样品中细菌群落丰富度更高；另外,取食巨园桉DH201-2的虫体内细菌Simpson指数(0.8403)高于取食窿缘桉的虫体细菌样品Simpson指数(0.5431)，而Shannon指数(0.6558)低于取食窿缘桉的虫体细菌样品Shannon指数(1.2522)，说明取食窿缘桉的虫体内细菌群落多样性更高；取食巨园桉DH201-2植株的虫体内细菌的Pielou值(0.12)低于以窿缘桉为寄主的样品(0.24)，说明以巨园桉DH201-2为寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌群落的均匀程度更低。

2.4 2种不同寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌组成与结构分析

寄主分别为巨园桉DH201-2和窿缘桉的桉树枝瘿姬小蜂体内共鉴定出230个细菌OTUs，隶属于14门24纲41目73科123属，其中有83个精确到了种。取食巨园桉DH201-2的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌得到的注释数比取食窿缘桉种群体内细菌的注释数更多。

根据不同寄主样品的OTU及OTU所代表的物种分析可知，桉树枝瘿姬小蜂体内细菌的16S rDNA基因序列共注释得到了14个门，分别为变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、放线菌门Actinobacteria、蓝细菌门Cyanobacteria、梭杆菌门Fusobacteria、Saccharibacteria、软壁菌门Tenericutes、疣微菌门Verrucomicrobia、TM6_[Dependentiae]、酸杆菌门Acidobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、Tectomicrobia和WWE3。

取食巨园桉DH201-2和窿缘桉寄主的样品内细菌在门分类水平上的相对丰度存在明显差异(图2A)，从来源于巨园桉DH201-2的样品中鉴定出了上述14个门，其中优势菌群为变形菌门(95.15%)(百分比为相对丰度，下同)，而厚壁菌门(1.57%)、放线菌门(1.50%)和拟杆菌门(1.23%)次之；来源于窿缘桉寄主的样品中所有序列均被鉴别出，共有10个门(变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、蓝细菌门、梭杆菌门、Saccharibacteria、软壁菌门、疣微菌门和酸杆菌门)，优势菌群为变形菌门(94.01%)，其次为拟杆菌门(4.25%)、厚壁菌门(0.81%)和放线菌门(0.46%)。由此可知，2个寄主样品体内细菌的优势菌门均为变形菌门，占比均大于90%，进一步说明在门分类水平上，不同寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌的主要类群具有一定的相似性。

在属水平上，来源于巨园桉DH201-2和窿缘桉2种寄主的样品共注释得到了123个属(图2B)，菌群丰度前10的类群是立克次氏体Rickettsia、泛菌属Pantoea、根瘤菌属Rhizobium、uncultured_bacterium_f_Bacteroidales_ S24-7_group、不动杆菌属Acinetobacter、拟杆菌属Bacteroides、丙酸杆菌属Propionibacterium、微杆菌属Microbacterium、乳酸杆菌属Lactobacillus、葡萄球菌属Staphylococcus。2种寄主材料体内菌群主要属的分布及优势菌属所占比例具有明显的差别。巨园桉DH201-2寄主样品体内菌群共有113个属，立克次氏体属为主要优势菌属，其相对丰度约为93.11%；在窿缘桉寄主样品体内细菌的优势菌属为立克次氏体属(73.61%)、泛菌属(10.84%)和根瘤菌属(8.01%)。虽然2种寄主材料的优势菌属均为立克次氏体属，但其相对丰度值存在较大差异，且次级优势菌属不同。

图2 2个寄主样品体内的细菌在门(A)和属(B)水平上的组成和结构Fig.2 Composition and structure of bacteria in two host samples at phylum(A) and genus(B) levels

3 讨论

昆虫体内分布着复杂多变的微生物种类，但是不同昆虫体内的微生物种类和含量存在一定的相似性。已有研究表明，厚壁菌门、变形菌门和放线菌门是昆虫体内细菌的优势菌群，如斜纹夜蛾SpodopteralituraFabricius幼虫、仁扇舟蛾Closterarestitura(walker)幼虫、伊凡氏叶螨TetranychusevansiBaker & Pritchard、二斑叶螨Tetranychusurticae(Koch)和荔枝蝽Tessaratomapapillosa(Drury)成虫体内优势菌门均为上述菌门(刘家生,2018; 孙博通等,2017; 朱晗等,2021； Ribeiroetal.,2019)，与本研究结果一致。内共生菌Rickettsia也广泛存在于昆虫体内，壮材小蠹Terminalinusspp.、烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)、白蜡虫EriceruspelaChavannes等昆虫体内发现立克次氏体为其细菌优势菌属(吕品等,2019; 薛延韬等,2017; 张玉婷等,2021)。取食2种不同植物的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌优势菌属也同为立克次氏体，这可能与桉树枝瘿姬小蜂的孤雌生殖有关。

昆虫体内细菌组成及多样性不仅受昆虫种类的影响，还与昆虫所取食物质有关(魏晓莹等,2019)。本研究对2种不同寄主条件的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌进行研究，发现取食2种不同寄主的桉树枝瘿姬小蜂体内细菌的种类和数量均存在差异，取食窿缘桉的桉树枝瘿姬小蜂体内立克次氏体属细菌的相对丰度更小，且体内次优势菌属的占比更大，这可能与不同食物的营养水平不同或昆虫对不同食物的消化吸收能力不同有关。3种取食不同寄主植物的叶蜂(河曲丝叶蜂NematushequensisXiao、落叶松叶蜂PristiphoraerichsoniiHavtig和松阿扁叶蜂AcantholydaposticalisMatsumura)幼虫肠道细菌组成存在很大差异(张帅帅等，2017)；取食柘叶与桑叶的家蚕体内优势菌群的组成存在较大的变化(向芸庆等,2010)；取食桑叶的广食性家蚕体内菌群多样性高于取食人工饲料种群(郝长富等,2019)；美国白蛾Hyphantriacunea(Drury)体内优势菌属因取食食料的不同而产生差别，而饲养条件的不同可显著影响橘小实蝇BactroceradorsalisHendel体内可培养细菌的种类(王洪秀等,2015; 魏丹峰等,2017)。以上研究表明,昆虫取食食物的不同会影响其体内细菌的多样性，与本试验的研究结果相符。也有研究指出，不同树种的桉叶粗提物对测试菌株的抑菌活性存在显著差异，这可能是不同品种桉树的有效成分不同，从而导致抑菌效果存在差异(杨巧丽,2013)。本研究采用的2种寄主为不同品种的桉树，故推测是由于不同桉树品种间有效成分的差异导致桉树枝瘿姬小蜂体内细菌的多样性和丰富度存在不同，而体内细菌种类及群落结构的可塑性变化是桉树枝瘿姬小蜂适应不同寄主植物的机制之一，但该假设有待进一步验证。

Rickettsia是一种寄生在细胞内的专性细菌，所有已知的与脊椎动物有关的Rickettsia均由节肢动物传播，主要为蜱、虱子、螨等，众多Rickettsia只在节肢动物中发现，没有已知的次级宿主(Huangetal.,2017)。研究表明,Rickettsia能操纵宿主昆虫繁殖、改变生殖方式、降低不良环境对宿主入侵的影响(Daisukeetal.,2012)。Rickettsia可以影响蚜虫的颜色，从而降低豌豆蚜被捕食或被寄生的机率(Tsuchidaetal.,2010)。王紫淇等(2020)发现,存留有Rickettsia的棉花植株能够促进烟粉虱的发育，提高其存活率及繁殖力，甚至延长其寿命，且烟粉虱体内的Rickettsia比存留在棉花植株上的Rickettsia对烟粉虱的影响更大。Giorginietal.(2010)的研究也表明，寄生蜂Pnigaliosoemius的孤雌生殖与Rickettsia有关，感染Rickettsia的寄生蜂仅产生雌性后代，抗生素处理后，寄生蜂的后代几乎全部为雄虫。Hagimorietal.(2006)报道了Rickettsia可影响芙新姬小蜂Neochrysocharisformosa的孤雌生殖。桉树枝瘿姬小蜂主要为孤雌生殖，Rickettsia作为其体内菌群优势菌属，可能对桉树枝瘿姬小蜂繁殖产生影响。Nugnesetal.(2015)研究表明，Rickettsia主要存在于桉树枝瘿姬小蜂的卵巢内，验证了其对桉树枝瘿姬小蜂孤雌生殖的诱导作用，但具体作用方式有待进一步研究。