李卓琳， 李德志， 毛 爽， 杨 帆， 蔺吉祥

(1.上海师范大学天华学院， 上海 201815； 2.华东师范大学生态与环境科学学院， 上海 200241；3.上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室， 上海 200241； 4.崇明生态研究院， 上海 202162；5.自然资源部大都市区国土空间生态修复工程技术创新中心， 上海 200062；6.东北林业大学园林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040)

土壤盐渍化日趋严峻，已成为世界性难题，严重影响着植物正常的生长发育[1-3]。全球盐渍化土壤面积约为9.5亿hm2，我国约3 600万hm2[4-5]。种子发芽和幼苗形态建成是植物生活周期中最脆弱也是极为重要的阶段[6]。种子作为植物生活史的重要环节，对物种延续起着至关重要的作用。种子能否在盐胁迫条件下萌发成苗也是植物种群繁衍的前提。由于长期对不同盐浓度环境的适应，同一植物种群也可能会产生不同的适应对策，从而发生趋异适应[7-8]。种皮不同是趋异适应的主要特征，种皮颜色的差异可能导致萌发时间、耐盐性和休眠特性等产生差异，甚至后代的生长发育也会发生适应性变化，这种多样性在一定程度增强了植物个体对多变环境的适应能力[9-10]。

海三棱藨草是莎草科多年生草本植物，也是我国的特有盐沼植物，其耐盐以及耐厌氧环境的特性使其成为原生裸地上的先锋植物[7-9]。目前，长江口是国内海三棱藨草分布面积最大的区域[10]，但在20世纪90年代后期，上海地区围垦引种了大量的互花米草，而互花米草快速扩张，对海三棱藨草的生境造成了极大的威胁，使得海三棱藨草适宜生存空间越来越窄[11]。另外，海三棱藨草不仅是中国的特有植物种，同时栖息在长江口盐沼上的二级保护动物水鸟类也以它的球茎、小坚果为食[12]，海三棱藨草种群的退化或丧失可能会间接导致二级保护动物更稀少。因此，探究海三棱藨草种子萌发对生境关键因子的响应是研究其种群恢复的关键。

目前从事植物生长发育及生理特征对盐胁迫响应的研究中有部分学者关注植物的表型可塑性问题[13-14]，因为植物在应对环境的改变时，往往被迫采取相应的适应对策，有时还会将这种适应能力传递给后代。有些植物在不同生境中产生的趋异适应在再次回到相同环境时消失，有些则持续[15]。前期野外调查中发现，不同生境下的海三棱藨草种子在百粒重等方面有显著差异，同时种皮颜色也不一致，具有较为明显的黄色、褐色和黑色的区别。不同生境(盐分不同)下的海三棱藨草种子在相同盐分处理时发芽率是否一致、两个生境下不同颜色的种子所占比例是否有差异等诸多适应对策问题还并不明确。因此，本研究通过探索来自两个生境的海三棱藨草种子在相同盐胁迫处理下的发芽率是否一致，来验证生境差异导致海三棱藨草产生的趋异适应在种子发芽阶段是否消失的问题；通过野外调查发现的三种不同颜色海三棱藨草的种子，进一步分析长期生活在两个生境下的海三棱藨草种子萌发的趋异适应问题，为恢复海三棱藨草种群筛选种子提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 野外调查与处理

供试海三棱藨草种子(百粒重约0.65 g)于2015年和2016年10月末采集于上海崇明东滩鸟类自然保护区北部海三棱藨草和海三棱藨草、互花米草混合群落处，简称生境A和生境B。生境A靠近光滩，属于低潮位，水分足，盐分低；生境B靠近大堤，属于中潮位，水分低于生境A而盐分高于生境A。在两个群落处随机剪取完整的穗大于等于100个，每个穗之间的采集距离至少为3 m。采集好的穗分别装入信封袋中，做好标记，挑选饱满的种子晾干。

在挑选种子的过程中，发现种子的颜色有差异，分别为黄色、棕色和黑色(图1)。将两个生境下不同颜色的种子进行简单清洗后分别浸泡在配置好的4‰NaCl盐溶液中，置于4 ℃冰箱中冷藏春化，于2017年3月进行室内种子发芽实验。海三棱藨草种子的发芽温度设置为昼/夜温度分别为18 ℃/28 ℃，低温8 h，高温14 h，光照时长为14 h。试验处理将NaCl溶液作为盐度添加成分，分别设置0、5‰、10‰、15‰和20‰等5个梯度，每个处理设4次重复(因种子数量原因，此处生境和盐分的交互实验中仅使用棕色种子)。

图1 不同颜色种子的对比

1.2 萌发指标测定

经过春化的种子在萌发实验之前再进行一次筛选，挑选大小基本一致的种子，之后用0.1%的次氯酸钠溶液浸泡10 min，充分消毒，然后再用蒸馏水冲洗干净，在自然条件下晾干后备用。

分别取30粒生境A和生境B的棕色海三棱藨草种子均匀平铺于双层滤纸的培养皿中进行发芽试验，培养皿的直径为12.5 cm。试验初始时，每皿加入10 mL相应的盐溶液作为处理组，蒸馏水作为对照组，记录初始重量，每个处理重复4次。之后每天用称重法补充蒸发失去的水分以保持盐浓度的基本恒定。将种皮前端开裂作为判断种皮开裂的标准，将种皮开裂露白作为判断种子萌发的标准。每天09：00时记录发芽的种子数量，试验共进行20 d。

种皮开裂率(%)=(种皮开裂的种子数/供试种子总数)×100%；

种子发芽率(%)=(发芽的种子数/供试种子总数)×100%。

1.3 数据统计分析

试验数据采用SPSS 21.0软件处理，生境位置和盐分的影响采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)，当双因素交互作用显著时，生境位置之间的差异采用独立样本t检验，不同浓度盐分影响的差异采用单因素方差分析，并进行多重比较。数据采用平均值±标准差表示，作图均应用sigmaplot 10.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对两个海三棱藨草种群种皮开裂率及种子发芽率的影响

由表1可知，海三棱藨草所处的生境位置和盐分及其交互作用均显著影响种皮的开裂率和种子的萌发率(p<0.05)。海三棱藨草种子在盐分浓度为15‰和20‰时种子的发芽率为0。在10‰时仅有6.7%的种子种皮开裂，但仍然没有种子发芽，表明盐分是限制海三棱藨草种子萌发的主要因素，而生境B种子的发芽率要高于生境A，这可能是长期生长在生境A和生境B环境下的海三棱藨草产生了不同的发芽适应对策。

表1 盐胁迫和生境位置对海三棱藨草种子萌发的影响

由图2可得，2015年种皮的开裂率及种子的萌发率均高于2016年。2015和2016年，两生境下海三棱藨草种皮的开裂比例和发芽率均随着盐浓度的升高而显著降低。

图2 盐胁迫对不同生境位置的海三棱藨草种子发芽进程的影响

在相同盐浓度条件下，生境A的海三棱藨草种皮开裂比例和种子萌发率均低于生境B的种子。2015年采回的种子在盐浓度为0和5‰时，生境B的海三棱藨草种皮开裂率分别比生境A的高20%和207.2%，而种子萌发率比生境A的高约10倍(p<0.05)。在盐浓度为10‰时虽有6.7%的种皮开裂，但已完全停止发芽。2016年采集回的种子在盐浓度为0时，生境B的海三棱藨草种皮开裂率比生境A的高12.5%，而在盐浓度为5‰时种皮开裂比率为0，但种子萌发率比生境A的高166.7%和100%(p<0.05)。以上结果表明，生境A和生境B的种子即使在相同的盐浓度下种皮裂开率和种子发芽率的差异并没有消失，生境B的种皮开裂比例和种子萌发率都高于生境A，且生境B的种子更耐盐。随着盐浓度的升高，即使种皮开裂，种子萌发的比率也明显降低。

2.2 两个生境不同颜色种子比例及种皮颜色对海三棱藨草种皮开裂率、种子发芽率的影响

如图3所示，生境A和生境B的海三棱藨草种群中都有黄、棕、黑3种颜色的种子，综合年份分析，3种颜色种子占采集种子总数的比例在年际间差异不大，但不同颜色种子在两个种群中所占的比例差异较大，其中生境A的黄色种子在2015年比生境B的多131.8%，在2016年比生境B的多159.8%；而生境A的棕色种子在2015年比生境B的减少了23.9%，在2016年比生境B的减少了29.5%；生境A 的黑色种子的比例也有所降低，分别比生境B的减少了62.5%和 50.2% (图3)。这可能是生境A的黄色种子占主导，而生境B中棕色种子占主导地位且黑色种子也显著增加。因此，可以得出生境B黑色种子所占比例高于生境A。

图3 生境对不同颜色种子所占比例的影响

由图4所得，黑色种子种皮的开裂率大于棕色种子和黄色种子，但种皮颜色对种皮开裂的比率影响并未达到显著水平(p>0.05)。然而黑色种皮种子的发芽率比棕色种子和黄色种子显著高42.5%和50%，黄色种子和棕色种子萌发率差异并不显著(p>0.05)。

注：小写字母代表不同种皮颜色对种子的发芽率具有显著效应。

3 讨 论

植物种子在萌发阶段往往会受到一系列环境因素共同的影响，植物一方面利用种子萌发可以扩张植物种群的分布范围，另一方面还可以保证种群基因多样性。一般来说，盐生植物对盐分具有较好的耐受性，土壤中盐分产生的渗透胁迫及有毒离子(如过量的Na+)产生的离子效应都会抑制种子萌发，并且是抑制种子萌发的关键因素[16-17]。微地形的变化也会造成水分和表土盐度的明显差异[18]。例如，在上海崇明东滩的一定高程内，随着高程的增加，土壤的含水量逐渐减少而盐度增加。盐生植物为适应动荡的环境而产生不同形态的种子，且种子的发芽率也完全不同[19]。

本研究结果表明，海三棱藨草种子的萌发率随着处理盐浓度的升高而降低。此外在超过10‰盐分处理的条件下，种皮虽然开裂，但种子并未萌发，这说明盐分是影响海三棱藨草种子萌发的主要因素之一。海三棱藨草虽然为盐生植物，但其多生长在低潮位(生境A)，水分多盐分相对低，所以它的原生环境盐分浓度也不足5‰，结果也表明海三棱藨草种子的萌发率在无盐分处理时最高，而在5‰时已显著降低，在10‰时基本失去萌发能力，这与Van等[20]的研究结果相一致。

在野外条件下，随着高程的增加，水分减少而盐分增加，海三棱藨草主要生长在低潮位，部分在中潮位和互花米草生长在一起，这可能是因为海三棱藨草的盐敏感性导致它向高程高的区域扩张极为困难，所以海三棱藨草主要在低潮位生长，少量在中潮位和入侵物种互花米草生长在一起。但也因海三棱藨草长期生活在不同的环境，它们在野外的生长情况也不相同。生境A的海三棱藨草长势整体优于生境B。

众所周知，同一植物长期生活在不同生境会发生趋异适应，这能在一定程度上降低其在异质生境下承受的环境压力，维持一定的适合度，这种以生理反应为基础的可塑性反应通常能在短时间内逆转，也不会对物种的适应性进化产生影响[15]。但现有研究也发现，虽然植物短时间内受到环境胁迫时植物表型的应答反应会随着胁迫的结束而消失，但在长时间的胁迫下，植物可能会将这种适应对策能力遗传给子代，因此如果发生趋异适应的植物在相同环境下的差异没有消失，这可能意味着植物在长期适应的过程中发生了适应性进化，而不仅仅是对环境的响应。Vu等[21]证明了来自盐生和非盐生环境苜蓿后代种子发芽的跨世代可塑性。本研究结果显示，海三棱藨草不仅在不同盐浓度下表现出差异，两个生境间也表现出显著差异(表1)，这表明取自两个生境的种子即使在相同的盐浓度下，种皮的开裂比例和种子发芽率也有所不同，因此在种子发芽这一部分印证了生长在两个生境下的海三棱藨草在种子发芽阶段的差异并未消失，且在盐分为5‰时，生境B的种子发芽率显著高于生境A,这与它们在野外植株的生长环境一致。

本研究中生境A位于低潮位，经受水淹的概率高于生境B，但是盐分却小于生境B，王亮等[22]研究也指出，海三棱藨草对抗水淹的能力要高于耐盐的能力。另外，海三棱藨草属于克隆植物，克隆植物在不同生境下会权衡有性和无性繁殖以达到最大的适合度。生境B的扰动更强，虽然种子少但是发芽率却相对较高，这也是有性繁殖成功的原因之一。王亮等[22]指出，海三棱藨草在密度高、竞争压力大的条件下基本放弃有性繁殖，将更多的能量用于无性繁殖，而相反地在密度相对低、竞争压力小的条件下有性繁殖。而张大勇等[23]指出，克隆植物在环境适宜时往往采用无性繁殖，而在火烧、干旱等环境波动较大的生境中会将更多的能量投资在有性繁殖上，因为种子进入种子库可休眠潜伏多年，在环境适宜时重新萌发生长，以维持种群的延续。本研究取样的两个生境分别位于低潮位(生境A)和中潮位(生境B)，生境A是海三棱藨草的主要分布区域，生境B是海三棱藨草和入侵物种互花米草的混合群落交错区，但是互花米草的地上部在取样当年已被机器打掉，但地下部的根茎并没有消失，所以物种间的竞争仍然存在，生境B的海三棱藨草种子发芽率要高于生境A, 这也支持了张大勇等[24]的研究结果。因此推测自然条件下产生的差异在海三棱藨草的种子发芽阶段并未消失，相关遗传学的试验在进一步验证中。

种皮的颜色是盐生植物对环境异质性的一种重要适应方式，又称之为种子的多态性，盐生植物通常产生黑色和褐色两种颜色的种子[24-25]，且各种形态的种子所占的比例也不同。产生不同形态种子的物种多定居于扰动比较强烈、环境恶劣的环境，逆境胁迫会给植株造成强大的选择压力，迫使种子发生变异以提高对环境的适应能力和种群繁殖的成功率，这也是植物在长期进化过程中逐渐演变出来的对策[26]。海三棱藨草作为先锋种，经历潮汐作用造成的水淹以及盐分等胁迫因子，所以也和很多盐生植物一样产生不同颜色的种子。

本研究结果显示，生境A的黄色种子所占比例最高，生境B的棕色种子所占比例最高，黑色种子虽然占比少，但是生境B的黑色种子所占比例显著高于生境A，且后续的发芽实验也显示出黑色种子的发芽率是最高的。此外，在比较两个生境对相同盐胁迫的响应差异是否消失时，本研究均采用量比较多的棕色种子，而生境B的棕色种子发芽率也高于生境A。上述结果表明，生境B的种子发芽率高于生境A，生境B的海三棱藨草也产生更多的黑色种子来提高其发芽率，所以无论是在提高高发芽率颜色种子的比例上，还是在提高种子耐盐性上，生境B的海三棱藨草都优于生境A，这可能是海三棱藨草长期生活在生境B产生的适应性策略。

4 结 论

海三棱藨草种子随着盐浓度的升高萌发率逐渐降低，最后为0，清水对照组发芽率最高，在10‰的盐浓度下仅有种皮开裂但并没有种子发芽，这表明盐分是限制海三棱藨草种子萌发的主要因素之一。

生境A和生境B的海三棱藨草种子(棕色)即使在相同的盐胁迫处理下差异也并没有消失，生境B的种子发芽率高于生境A，且生境B的种子耐盐性高于生境A的种子。这可能是海三棱藨草种子发芽阶段在长期适应的过程中发生了适应性进化，而不仅仅是对环境的短期响应。

生境B的黑色种子占比显著高于生境A,且黑色种子的萌发率要高于黄色和棕色种子，所以生境B海三棱藨草种子无论是在提高高发芽率颜色种子的比例上，还是在提高种子耐盐性上，生境B的海三棱藨草种子都优于生境A。因此，想利用种子恢复海三棱藨草种群，可以尽量选择深色且耐盐性更高的生境B的种子。