陈芊如 余佳敏 胡希好 苟春苗 丁蓬勃 荆常亮 杨英杰 李斌 李义强

摘  要：为控制烟叶中多菌灵农药残留，利用降解酶基因质粒载体克隆技术，合成构建了对多菌灵具有较好降解效果的菌株MBC2019，并进一步筛选优化了其发酵条件和最佳浓度，研究了降解菌在烟叶种植、烘烤和打叶复烤阶段对烟叶多菌灵农药残留降解的效果。结果表明，降解菌的最佳培养温度为28 ℃，最适培养pH为7.0，最优接种浓度为3.00%。种植阶段，喷施多菌灵和降解菌后3～7 d，未喷施降解菌烟叶中农药残留降解速度快于降解菌处理，14 d后降解菌的促进效果开始显现，未使用降解菌的降解率为96.55%，使用降解菌的降解率提高到99.58%;在烘烤和打叶复烤阶段，未使用降解菌的烟叶中多菌灵降解较慢，120 h降解率为8.07%和8.05%，喷施降解菌后，同期降解率分别达到77.97%和45.08%。因此该降解菌可用于烟叶种植，特别是烘烤和打叶复烤等阶段的多菌灵农药残留降解，具有良好的应用前景。

关键词：多菌灵;农药残留;烟叶种植;烘烤;打叶复烤;微生物降解

Abstract： In order to control carbendazim pesticide residues in tobacco leaves， the strain MBC2019 with good degradation effect on carbendazim was synthesized and constructed by using the cloning technology of degradation enzyme gene plasmid vector. The fermentation conditions and optimal concentration were screened and optimized， and the degradation effects of carbendazim pesticide residues in tobacco leaves during planting and curing and redrying were evaluated. The results were as follows： the degradation bacteria was successfully synthesized and constructed， the optimal culture temperature was 28 ℃ and pH was 7.0， and the best inoculation concentration was 3.00%. In the field conditions， the pesticide residues in tobacco leaves were degraded rapidly due to photolysis， growth dilution， microbial degradation and other factors in 3-7 days. The degradation-promoting effect of degrading bacteria began to appear 14 days later. At this point， the degradation rates were 96.55% without application and 99.58% with application in tobacco leaves. During curing and redrying stages， the carbendazim degradation rates were 8.07% and 8.05% without application， differing from the degradation rates of 77.97% and 45.08% with application at 120 h. The degradation bacteria could be used to degrade carbendazim residues in tobacco leaves at different stages， especially at the curing and redrying stages， which showed a good application prospect.

Keywords： carbendazim; pesticide residues; tobacco planting; curing; redrying; microbial degradation

多菌靈作为一种内吸性杀菌剂，具有高效、低毒、广谱的特点，对农作物的白粉病、根黑腐病、赤星病等[1]有较好的防治效果，在农作物生产中使用普遍，烟叶样品中多菌灵农药残留检出率高，对烟叶的品质与安全有较大影响[2]。目前烟叶中多菌灵农药残留量限量值为2 mg/kg，被作为一类风险农药管理[3]。为进一步明确多菌灵农药残留的形成机理与降解对策，国内外专家针对烟叶中多菌灵残留展开了一系列研究[4]，明确了其在烟叶冻干、杀青过程中的降解规律和有效降解方式。由于微生物降解范围广、代谢方式丰富多样，通过筛选农药降解微生物来降低烟叶中的农药残留，是一种成本低廉、无毒无害的方法[7]。目前，已经报道的多菌灵降解菌有红球菌属（Rhodococcus）[6]、芽孢杆菌属（Bacillus）[8]、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia），以及假单胞菌属（Pseudomonas）[9]等。然而天然菌株代谢产物复杂多样，可能对环境及人畜安全造成威胁，且培养条件复杂、生长较慢，容易导致产酶不足、降解效果不佳等问题。为了解决以上问题，本研究将特异性多菌灵降解酶基因与遗传背景清楚、安全无威胁、不具备多菌灵降解功能的天然菌株相结合，利用基因质粒载体克隆技术进行多菌灵降解工程菌的构建，并进一步优化了其培养条件，开展了在烟叶种植阶段、烘烤阶段和打叶复烤阶段，降解菌对烟叶中多菌灵降解效果的研究评价，为开发降解烤烟中多菌灵的微生物菌剂提供技术依据。

1  材料与方法

1.1  供試材料

本试验于2020年7—10月在中国农业科学院烟草研究所青岛试验基地和四川烟叶复烤有限责任公司进行。供试烤烟品种为云烟97。供试基因序列KX698097、质粒pUC57、质粒pHT43、枯草芽孢杆菌WB800N，均来自青岛蔚蓝生物股份有限公司。供试农药为50%多菌灵可湿性粉剂，购自江苏省江阴市农药二厂有限公司。

1.2  试验方法

1.2.1  多菌灵降解菌的构建与鉴定  以多菌灵降解菌Mycobacterium sp. SD-4[10]为基础，针对降解酶基因KX698097进行密码子优化，合成适宜在芽孢杆菌中表达的基因，将合成后的基因克隆到pUC57（2.7 kb）质粒载体中，再利用枯草芽孢杆菌WB800N和新的质粒pHT43进行克隆表达，筛选符合要求的菌株，并进行形态学和生理生化特征鉴定。构建的菌株最终命名为MBC2019。

1.2.2  降解菌培养条件优化  （1）降解菌母液的制备：配制LB液体培养基，接种MBC2019单菌落，于28 ℃、180 r/min的条件下培养至对数生长期，即为降解菌母液。（2）降解菌最佳培养条件优化：将母液分别接种到新的LB液体培养基中，接种量为3.00%（V/V，下同），按上述条件培养36 h后，以菌株生长量OD600值为指标，分别测定不同温度（10、15、20、25、28、30、35、42 ℃）及不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）对菌株MBC2019生长的影响。

1.2.3  MBC2019菌液对多菌灵残留最佳降解浓度试验  在50 mL离心管中，加入含有多菌灵残留的烤后烟叶，加水稀释，取适量降解菌母液，建立5.00 mg/L农药和不同接种量（0.50%、1.00%、3.00%和10.00%）的降解菌液反应体系，混匀后静置培养。并于2、6、12、24、48、72 h后，取样测定多菌灵残留量，评价降解效果。

1.2.4  MBC2019菌液对不同阶段烟叶中多菌灵残留降解试验  MBC2019降解菌母液以3.00%的接种量用清水稀释，备用。多菌灵在常规作物中登记用量为1125～1500 g a.i./hm2[11]，按照农药残留试验准则要求，试验剂量采用登记的最高剂量[12]。选择进入采烤期且生长整齐一致的烟株，按照多菌灵有效成分1500 g a.i./hm2用量进行叶面喷雾施药。

（1）烟叶种植阶段：在烟草现蕾期—成熟期进行施药[13]，施药后3 h，叶片上均匀喷洒3.00%的MBC2019菌液，以在叶片上喷施等量清水作为对照。喷施菌液后1、3、5、7、14、21、30 d，采集鲜烟叶样品0.5 kg左右，剔除主脉，切碎叶片混匀，四分法缩分为200 g，装入自封袋中，−20 ℃保存，待测。

（2）烟叶烘烤阶段：在烟草成熟期田间喷施降解菌5 d后，采集使用降解菌和未使用降解菌的烟叶样品，每个样品采样点不少于12个（叶片不少于50片）。采用三段式烘烤工艺（不超过68 ℃）烘烤，分别在不同时间（24、48、72、96和120 h）取样，于烘箱内65 ℃烘干后去除主脉，研磨后缩分取200 g，−20 ℃保存，待测。

（3）烟叶打叶复烤阶段：用经检测确认不含多菌灵的烤后烟叶1 kg，烟叶表面喷施多菌灵农药并充分混匀，经检测烟叶中多菌灵残留量为5 mg/kg。一半样品喷施降解菌，另一半样品喷施清水作为对照，按照温度80 ℃、回潮混合水30%的复烤工艺[14]进行复烤，复烤后烟叶打包捆扎，存于纸箱内，并于烤后不同时间（24、48、72、96和120 h）取样，于烘箱内65 ℃烘干后研磨均匀，缩分后取200 g，−20 ℃保存，待测。

1.3  农药残留检测方法

1.3.1  提取净化和农药残留检测  参考李义强等[4]的方法，优化形成了QuEchERS前处理与HPLC-MS/MS检测相结合的烟叶中农药残留量测定方法，通过0.01、0.1和2 mg/kg 3个水平的添加回收率，验证方法的准确度和精密度。

1.3.2  标准曲线、添加回收试验  参考文献[15]方法。

1.4  数据分析

图表中的数值为平均值±标准偏差（mean±SD）表示（n=3）;各处理之间的差异显著性分析采用邓肯法，显著水平为p≤0.05。

2  结  果

2.1  多菌灵降解菌的构建、鉴定与培养条件优化

利用人工合成DNA技术，以多菌灵降解酶基因KX698097为模板，合成适宜在芽孢杆菌中表达的基因，并克隆到pUC57质粒载体中，利用引物djlF（AAGGATCCATGGCCAACTTCGT）和djlR（AATGGTGGTGGTAACTAGATCT）扩增得到片段，通过限制性酶切位点BamHI和XbaI连接克隆到表达载体pHT43中（图1），经测序确认序列无误后，电转到枯草芽孢杆菌进行发酵表达。最终利用枯草芽孢杆菌WB800N进行异源表达。

构建多菌灵降解菌后，进一步开展大规模发酵，对枯草芽孢杆菌WB800N表达系统进行培养条件优化。该菌株在LB平板上的菌落形态为奶白色、表面光滑、不透明、较为粘稠（图2），根据菌株的形态特征和16S rDNA基因序列Blast比对分析，最终菌株鉴定为Bacillus subtilis，并将其命名为MBC2019（现保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC18631）。

菌株MBC2019的培养温度与pH对其生长的影响如图3所示，在15～42 ℃之间，随着温度的升高，菌株MBC2019生长呈先上升后下降趋势，生长势顶点温度是28 ℃;当培养液的pH为6～8时，菌株MBC2019的生长近乎不受影响。通过上述筛选试验，选定菌株MBC2019的培养温度为28 ℃，培养pH为7.0。利用该条件培养菌株MBC2019并制备大量降解菌液，进行后续多菌灵农药残留降解试验。

2.2  MBC2019菌液降解多菌靈残留的最佳浓度筛选

MBC2019菌液浓度对多菌灵残留降解效果如图4所示，按照1.2.3方法所述，建立反应体系，在反应体系培养的前12 h内，接种量为10.00%的处理效果最佳。当处理时间大于24 h，MBC2019菌液接种浓度为3.00%时，多菌灵降解率均为最高，说明3.00%接种浓度的菌液降解效率稳定且效果最佳。因此，在后续试验中，选择3.00%的接种浓度进一步开展烟叶种植、烘烤和打叶复烤阶段多菌灵降解效果试验。

2.3  MBC2019菌液对不同阶段烟叶多菌灵残留降解的影响

2.3.1  烟叶种植阶段  如图5所示，试验前期3～7 d内，由于降解菌定殖过程对其自然降解存在干扰，未使用降解菌的烟叶中多菌灵残留降解较快。然而随着处理时间的延长，MBC2019处理效果逐步显现，14 d后，使用降解菌的处理降解率可达99.58%，显著高于未使用降解菌的处理（96.55%）;因此在烟叶种植阶段，喷施MBC2019菌液一段时间后对烟叶中多菌灵残留的降解有明显促进作用。

2.3.2  烟叶烘烤阶段  如图6所示，在烟叶烘烤过程中，未使用MBC2019时多菌灵降解缓慢，降解率较低，120 h时多菌灵残留降解率仅为8.07%;使用降解菌后，多菌灵降解速率加快，在24 h时降解率已显著高于未使用降解菌处理，120 h时，喷施MBC2019烟叶中多菌灵的降解率可达77.97%，与未使用降解菌的烟叶相比，多菌灵降解率提高了9倍以上。表明MBC2019可以显著促进烘烤烟叶中多菌灵残留的降解。

2.3.3  烟叶打叶复烤阶段  如图7所示，在打叶复烤过程中，未使用MBC2019降解菌时多菌灵降解缓慢，120 h时多菌灵残留降解率为8.05%;使用降解菌后，多菌灵残留降解速度加快，在复烤后24 h时降解率显著高于未使用降解菌的处理;在复烤后120 h时，使用降解菌处理的烟叶中，多菌灵的降解率达45.08%。表明在打叶复烤前喷施MBC2019可以显著降低复烤后烟叶中多菌灵的残留量。

3  讨  论

本试验以多菌灵降解酶基因KX698097为基础，合成适宜于芽孢杆菌中表达的基因，最终成功转化到枯草芽孢杆菌WB800N中并表达，得到了高效降解多菌灵的微生物菌株MBC2019，该菌最佳生长温度为28 ℃，最佳培养pH 7.0。按照不同浓度使用后，在0～72 h内对多菌灵的降解效果差异明显，其中，12 h内，10%接种量的菌液降解效果最佳，24 h以后，3.00%接种量菌液降解效果最佳，在72 h达到峰值，其降解率高达92.32%。

MBC2019菌液对烟叶种植阶段烟叶中多菌灵残留降解结果显示，14 d后，田间多菌灵残留的降解率表现为使用降解菌显著高于未使用降解菌;而3～7 d内的结果则与之相反，推测原因可能有两种，一是由于温度、湿度和光照等外部条件影响，植物体内的酶对叶片表面及叶肉组织中的农药残留可以明显降解[16];二是由于田间环境多变且复杂，MBC2019需要一定时间适应环境，同时烟叶表面存在其他微生物，而喷施MBC2019菌液后干扰了其他微生物的代谢，同时也抑制了光解和风逸散等效果[17]，导致降解速率减缓。

烘烤和打叶复烤阶段的多菌灵降解率较低，这是因为烘烤和复烤期间的农药降解往往是微生物和物理性作用的共同结果，由于多菌灵是内吸性杀菌剂，因而对微生物降解作用不利[18]，同时烟叶烘烤过程水分大量散失，会干扰微生物的作用，烟叶中的农药残留降解会受到较大程度的抑制[19]，由此造成了烘烤和复烤期间多菌灵降解缓慢的结果。试验结果显示，烘烤前使用MBC2019降解菌可以显著提高烘烤过程中多菌灵残留的降解率，促进降解效率可达9倍以上。尤其是烘烤前期促进多菌灵降解的效果明显提升，这是由于在烘烤过程中，前期以高温高湿为主，烟叶处于变黄期和定色前期，降解菌的活性较高，对农药降解较快[20];而在烘烤中后期高温和低湿条件使微生物彻底失活[19]。在打叶复烤阶段，喷施降解菌液后，对烟叶中多菌灵的降解有一定的促进作用，但与前两个阶段相比有所放缓，可能与复烤前期烟叶失水，降解菌活性不能充分发挥有关[21]，但相比未使用降解菌的烟叶，使用降解菌后烟叶中多菌灵的降解率显著提升。

综上所述，在烟叶种植阶段，由于光解、自然降解、生长稀释等多种因素影响，多菌灵农药残留在自然状态下降解较快。虽然施用MBC2019降解菌，但前14 d的效果不及自然降解效果明显，14 d后，降解菌的促进降解作用开始显现。与未施用降解菌的处理相比，降解菌在烘烤阶段和打叶复烤阶段，表现出较强的促进降解活性，大大加速了多菌灵的降解[18]。根据本研究结果，烟叶种植阶段施用降解菌，要早于采烤前14 d施用才能发挥其效果;烘烤和打叶复烤阶段，只要施用降解菌即可发挥其降解效果促进烟叶中的多菌灵降解，提升烟叶安全性。

4  结  论

本研究开发了一株可以显著降解多菌灵农药残留的枯草芽孢杆菌MBC2019，该菌最佳生长温度为28 ℃，最佳培养pH 7.0。以3.00%的稀释比例制备的菌液降解效率稳定且效果最佳。该降解菌在烟叶采烤前14 d和打叶复烤前喷施，对多菌灵残留均有显著促进降解的效果。

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