张志东，陈爱华，吴杨平，张 雨，曹 奕，陈素华，田 镇，李秋洁

( 江苏省海洋水产研究所，江苏省文蛤良种场，江苏省海洋经济贝类研发中心，江苏 南通 226007 )

微藻为形体微小且只能在显微镜下才能分辨其形态的藻类总称[1]。其种类繁多，在海洋、湖泊、河流、池塘及水库等各类水体中均有分布。目前已探知的微藻中，绝大部分营自养生活，其可通过自身的光能转化作用直接从水体中吸收氮、磷元素，并通过氧化磷酸化作用合成腺苷三磷酸为细胞供能，完成生长繁殖[2-3]。在此过程中产生的氧气可改善水质，同时自身又可作为水产动物的饵料，提高水产品品质[4]。因此，微藻在水产生态养殖及其水环境调控中具有重要作用，利用微藻降低或消除富营养化水体中的氮、磷等元素含量具有极大潜力。然而，当水体中氮、磷超过一定阈值，水体中微藻将大量繁殖，导致水华，从而破坏水域生态系统平衡。针对微藻过量繁殖的现象，实验室常用固定化微藻技术控制微藻繁殖，达到水质净化的目的[3,5]。然而该技术成本高，难以实现推广，因此在实际生产中仍用滤食性贝类摄食过量微藻，使水体中微藻数量保持在适宜的范围[6-7]。

贝类拥有强大的滤食能力，对水体中藻相结构产生重要影响。有研究显示，在鱼池内混养三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)可控制浮游藻类数量，促进养殖水体中大型藻类的生长，进而提高养殖水体的生物总量[7]。朱小龙等[8]研究发现，河蚬(Corbiculafluminea)能有效抑制富营养化湖泊中藻类暴发现象。方磊等[9]认为，贝类如果过量摄食会产生大量“假粪”，此过程虽无法完全消除藻类，但经过贝类消化道的藻类，被贝类黏液包裹，其生长繁殖受到一定抑制。即便假粪中的藻类被再次搅动激活，也只有其中一部分能被激活。因此混养滤食性贝类对提高池塘养殖产量、池塘养殖模式优化具有积极意义。然而目前有关滤食性贝类去除水体氮、磷的研究均在海洋、湖泊、池塘等大水域环境下进行，忽略了水域中微藻的作用。单独放养贝类及在有藻和无藻的环境中对水体中氮、磷营养盐的消除效果研究尚未见报道。因此，笔者以文蛤(Meretrixmeretrix)为研究对象，比较其在有藻和无藻情况下对水体中无机氮及无机磷的消除差异，并通过响应面法优化出文蛤和微藻的最佳的搭配条件，旨在为水质调控及池塘养殖技术优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用文蛤与微藻均来自江苏省文蛤良种场，其中文蛤为红壳色选育系子四代，自养殖池塘取出后在室内砂滤海水暂养7 d，日投喂1×105个/mL的球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)1次，并换水1次。试验前2 d停止投喂，挑选健康、规格相近个体进行试验，平均壳长为(25.91±2.76) mm，平均体质量为(4.30±1.08) g。试验用水为二次煮沸的砂滤海水添加硝酸钠、氯化铵及磷酸二氢钾配制。氮、磷初始指标为：无机氮1.65 mg/L、无机磷0.23 mg/L。底泥采于江苏吕四滩涂，运回实验室后，用烘箱烘干，用于试验。

1.2 试验设计

1.2.1 定性试验

试验在12个68 cm×46 cm×35 cm聚乙烯水槽中进行，设计有贝无藻组(A组)、无贝有藻组(B组)及有贝有藻组(AB组)3个试验组，以无贝无藻组(O组)为对照组，每组设3个平行。文蛤放养密度为225个/m2。有藻试验组初始投喂球等鞭金藻约为1.6×106个/mL，待贝类摄食效率与微藻生长效率基本持平后不再投喂，微藻密度基本保持稳定。试验为静水试验，每个水槽中平铺100 g底泥。在试验开始后3、6、12、24、48、72、96 h各取300 mL水样，4%甲醛固定，用于水质指标的测定。

1.2.2 定量试验

在定性试验的基础上发现，有贝有藻组对水体无机氮及无机磷吸收效果较好。因此针对有贝有藻组结果进行定量化分析，按照中心组合设计(CCD)设置13组多因素试验(表1)，通过响应曲面设计方法(RSM)建立回归模型，并对回归方程进行方差分析及显著性检验。以水体无机氮、无机磷日消除率(RIN和RIP)为指标，运用中心组合设计模型，选择双因素三水平的中心组合方案，以文蛤密度和微藻密度(所用藻类为球等鞭金藻)为考察因素，进行响应面试验，试验因素水平及结果见表1，试验共持续4 d，试验装置及方法同定性试验有贝有藻组。

表1 试验设计与结果Tab.1 Central-Composite design with the observed responses

1.3 水体氮、磷的测定与计算

试验测定的水质指标主要包括水体中氨氮(NH4+-N)、亚硝态氮(NO2--N)、硝态氮(NO3--N)、无机氮(IN)、无机磷(IP)。氨氮通过次溴酸盐氧化法测定，亚硝态氮通过磺胺—盐酸萘乙二胺法测定，硝态氮采用锌镉还原法测定，无机磷通过钼蓝分光光度法测定；无机氮质量浓度(ρIN)及无机氮日消除率(RIN)及无机磷日消除率(RIP)计算公式如下：

ρIN=ρ1+ρ2+ρ3

RIN=(ρIN, 0-ρIN, t)/(ρIN, 0×t)×100%

RIP=(ρIP, 0-ρIP, t)/(ρIP, 0×t)×100%

式中，ρIN为水体无机氮质量浓度(mg/L)，ρ1、ρ2及ρ3分别为水体氨氮、亚硝态氮及硝态氮质量浓度(mg/L)，ρIN, 0及ρIP, 0为无机氮及无机磷初始质量浓度(mg/L)，t为试验时间(d)，ρIN, t及ρIP, t为在t时间无机氮及无机磷质量浓度(mg/L)。

1.4 数据统计

定性试验数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，用Origin 8.0作图。定量试验根据Design-expert 8.0软件中中心组合设计模型设置试验组，用该软件进行二元二次多项式回归分析和方差分析。

2 结 果

2.1 文蛤及微藻对水体无机氮及无机磷质量浓度的影响

由图1可见，随着试验的进行，有贝无藻组氨氮质量浓度较无贝无藻组无显著变化(P>0.05)；无贝有藻组和有贝有藻组氨氮和无机氮质量浓度显著低于无贝无藻组(P<0.05)。有贝无藻组和无贝有藻组亚硝态氮质量浓度随着时间的延长，有明显升高趋势(P<0.05)，而有贝有藻组显著低于有贝无藻组和无贝有藻组(P<0.05)。试验结束时，有贝无藻组和有贝有藻组硝态氮质量浓度显著低于无贝无藻组和无贝有藻组(P<0.05)。由图2可见，随着时间的延长，有贝无藻组无机磷质量浓度无明显变化，无贝有藻组和有贝有藻组无机磷质量浓度较无贝无藻组有明显下降趋势(P<0.05)，而无贝有藻组和有贝有藻组之间差异显著(P<0.05)。

图1 文蛤及微藻对水体无机氮质量浓度影响Tab.1 Effects of hard clam M. meretrix and microalga on concentration of inorganic nitrogen in watera.氨氮； b.亚硝态氮； c.硝态氮； d.无机氮； O.无贝无藻组； A.有贝无藻组； B.无贝有藻组； AB.有贝有藻组；柱状图上方不同的小写字母表示同一时间不同试验组之间差异显著(P<0.05)；下同.a.ammonia nitrogen; b.nitrite; c.nitrate; d.inorganic nitrogen; O.no clam without algae group; A.clam without algae group; B.algae without clam group; AB.clam with algae group; different letters above the bar chart indicate significant differences between different groups at the same time (P<0.05); et sequentia.

图2 文蛤及微藻对水体无机磷质量浓度影响Tab.2 Effects of hard clam M. meretrix and microalgae on concentration of inorganic phosphorus in water

2.2 文蛤及微藻对水体无机氮和无机磷日消除率响应面法分析

定量试验结果显示(表2、表3)，水体无机氮日消除率及无机磷消除率回归模型的F值分别为26.81和32.30，P<0.01，表明中心组合设计优化法可靠，文蛤密度和微藻密度对无机氮消除率及无机磷消除率的影响显著，模型具有统计学意义。其次，两个模型的拟合系数(r2)分别为0.9504和0.9585，说明模型预测值与实测值拟合度高。校正决定系数(Adjr2)分别为0.9149和0.9288，均可解释数据变异性的90%以上。精密度分别为11.992%和13.087%，说明回归模型可以准确反映结果。另外，文蛤密度一次效应对水体无机氮及无机磷日消除率影响不显著(P>0.05)；微藻密度一次效应对水体无机氮及无机磷日消除率影响显著(P<0.05)；文蛤密度和微藻密度交互效应对水体无机氮及无机磷日消除率影响显著(P<0.05)；文蛤密度和微藻密度二次效应对水体无机氮及无机磷日消除率影响极显著(P<0.01)。根据方差分析结果得出水体无机氮及无机磷消除率二次多项回归方程为：

表2 回归模型方差分析(RIN)Tab.2 ANOVA for the regression models (RIN)

表3 回归模型方差分析(RIP)Tab.3 ANOVA for the regression models (RIP)

水体无机氮日消除率(RIN)预测值对文蛤密度(A)和微藻密度(B)的二次多项回归方程为：

RIN=-0.29+1.46×10-3A+2.07×10-3B+2.22×10-6AB-4.26×10-6A2-6.63×10-6B2

水体无机磷日消除率(RIP)预测值对文蛤密度(A)和微藻密度(B)的二次多项回归方程为：

RIP=-0.28+1.50×10-3A+2.12×10-3B+2.04×10-6AB-4.27×10-6A2-6.67×10-6B2

根据上述公式所建立的数学模型及响应面结果见图3，水体无机氮及无机磷日消除率的最佳条件为：文蛤密度221个/m3，微藻密度1.92×106个/mL，此条件水体无机氮及无机磷消除率分别为6.93%和8.60%。

图3 交互作用对水体无机氮和无机磷日消除率影响的响应面分析Fig.3 Response surface showing interactive effects of factors affecting daily removal rates of inorganic nitrogen and phosphorus

2.3 模型验证

通过中心组合设计构建的响应面模型获得了水体无机氮和无机磷日消除率最大时文蛤和微藻的密度搭配比例。通过实际试验对模型拟合结果进行验证。预测结果与实际结果见表4，验证结果表明该模型分析结果准确。

表4 试验结果验证Tab.4 Verification of experimental results

3 讨 论

3.1 文蛤对水体无机氮及无机磷含量的影响

贝类的滤食、排泄、管道筑建及穴居等生理活动对养殖水体会产生重要影响[10]。本试验结果显示，单放文蛤组(有贝无藻组)对水体无机氮及无机磷含量影响不显著(P<0.05)，这可能与文蛤在清水态(无藻)环境中与外界物质交换量减少、滤水率下降有关。另外，在清水态环境下，文蛤长期处于饥饿胁迫之中，排氨率明显上升。这可能也是水体无机氮居高不下的原因之一[11]。因此，在文蛤养殖过程中应及时注入“肥水”，使之与外界环境之间有充足的物质交换，从而有利于文蛤对氮、磷的吸收。在投喂微藻后(有贝有藻组)，水体中无机氮及无机磷含量显著降低(P<0.05)，且文蛤密度和微藻密度的交互效应显著(P<0.05)，据此推测文蛤与微藻对富营养化水体调控存在一定的正反馈效应。贝类能降低水体氮、磷含量，一方面贝类对水体中微藻和悬浮物高强度滤食，另一方面贝类对底层藻类的生长具有促进作用，抑制了沉积物营养释放，从而间接降低水体氮、磷含量[10]。但贝类放养密度不宜过高，放养密度过高时，贝类会形成大量假粪，通过微生物作用及自身的生物扰动，加快系统的矿化反应，向水体中释放大量无机氮及无机磷[12]。本试验结果显示，文蛤放养密度约221个/m2时，对水体无机氮及无机磷日消除率达到最大，不足或超过此放养密度时，无机氮及无机磷消除效果均一般，与上述规律一致。

3.2 微藻对水体无机氮及无机磷含量的影响

微藻在水生生态系统中起着重要作用。它能吸收水体中无机氮和无机磷，并通过光能转化作用将其变为自身的组成物质，完成元素的转移[13]。本试验结果显示，单放微藻组(无贝有藻组)能显著降低水体中无机氮(主要是氨氮)和无机磷含量(P<0.05)，与上述规律一致。而无贝有藻组亚硝态氮含量有明显上升趋势(P<0.05)，说明藻类对水体中亚硝态氮利用效率很低。McCarthy等[14]研究认为，水体中藻类利用各种形式氮的优先顺序为氨氮>硝态氮>亚硝态氮，其原因是同化亚硝态氮的过程需要更多的能量[14-15]。窦勇等[16-17]在研究威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)及小球藻(Chlorellavulgaris)氮、磷吸收情况时，发现相似规律。而微藻对水体中无机氮及无机磷的吸收效果与其密度有关，当水生生态系统中微藻密度很高时，一方面，其自身生长受到抑制，氮、磷吸收效率降低，另一方面，其生物固氮作用加强，从而将氮气还原为氨氮，使水体中无机氮含量未降反升[18]。而且微藻密度过高时，会影响生态系统的稳定性。因此，本试验通过响应面法优化出微藻的密度约为192万个/mL时，对水体的氮、磷消除率达到最大，与上述规律一致。常用滤食性贝类可以控制水体微藻密度过高现象，防止水华的发生。

本试验通过响应面法拟合出文蛤和藻类搭配的最佳比例为：文蛤密度221 个/m2、微藻密度192万个/mL，此时对水体无机氮及无机磷日消除率达到最大，分别为6.93%和8.60%。由于实际操作过程中无法做到如此精细，故文蛤密度约225个/m2(15万个/亩)，微藻密度约200万个/mL即可。模型验证可靠，可用于实际生产中。另外，在实际生产中，分析文蛤及微藻对无机氮及无机磷消除效果时，还应充分考虑温度、盐度及光照度等因素[19]。

4 结 论

在清水态环境(无藻)中，文蛤对水体无机氮及无机磷消除效果有限，需添加微藻与其协同作用，才可降低水体无机氮及无机磷含量。在实际生产中，文蛤密度约225 个/m2(15万个/亩)，微藻密度约为200万个/mL，可对水体无机氮及无机磷达到最大消除效果，此时无机氮及无机磷日消除率分别为(6.90±0.33)%和(8.57±0.29)%。