鲍 晨，董学敏，杨静茹，胡倩倩，柳 俊△，米 琳，王 勇

1.安康市中心医院病理科，陕西安康 725000;2.安康市中心医院肾内科，陕西安康 725000;3.陕西省人民医院肾内科，陕西西安 710068

透明细胞性肾细胞癌(ccRCC)是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，是ccRCC最常见的病理类型，每年发病率为4.99/10万[1]。早期ccRCC的治疗以根治性手术为主，对于晚期转移性ccRCC以内科综合治疗如靶向治疗、免疫治疗等为主[2]。约31%的ccRCC患者术后出现复发转移的现象，最终导致患者不良生存预后的发生[3]。深入研究ccRCC机制，对ccRCC的诊治具有重要的临床价值。热休克蛋白60(HSP60)是线粒体中主要的ATP依赖分子伴侣，在维持线粒体蛋白稳态中起至关重要的作用。有文献表明，HSP60参与包括病毒性感染、炎症性肠病等多种炎症性疾病等许多复杂的生理病理过程[4-5]。有研究发现，HSP60在人类多种肿瘤中存在异常表达升高或降低的现象，HSP60能够促进肿瘤细胞存活、抑制凋亡和促进肿瘤血管生成，是一种新的肿瘤标志物，有利于判断肿瘤患者的预后[6]。核因子E2相关因子2(NRF2)基因位于2q31.2，该基因编码蛋白是一种重要的转录因子，能够结合下游靶基因启动子中的ARE反应元件，参与正常细胞的发育和分化的调节过程。NRF2与肿瘤的发生、发展关系密切。研究表明，在非小细胞肺癌等恶性肿瘤中NRF2表达上调，NRF2能够激活磷脂酰肌醇3激酶信号通路，导致下游AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的过度激活，促进肿瘤的恶性增殖，是肿瘤患者不良预后的重要标志物[7]。目前HSP60、NRF2在ccRCC中的表达及相互作用关系尚不清楚。本研究通过检测ccRCC中HSP60、NRF2的表达，初步探讨其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年3月至2019年3月在安康市中心医院(下称本院)行ccRCC根治术或保留肾单位手术的89例ccRCC患者为研究对象，其中男52例，女37例；年龄37～74岁、平均(49.1±6.3)岁；病理Furhman分级：1+2级33例，3+4级56例；肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期24例；伴远处转移19例，无远处转移70例；伴淋巴结转移 12例，无淋巴结转移76例。纳入标准：(1)首次发现，无放化疗及免疫治疗史。(2)病理组织学检查明确为ccRCC。(3)一般状况良好，能够耐受手术。排除标准：(1)合并精神障碍性疾病，不能配合治疗。(2)合并慢性肾病、肾功能衰竭。(3)合并其他恶性肿瘤。患者和家属均知情同意并签字，本研究经本院伦理委员会审核批准。

1.2荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测HSP60、NRF2 mRNA表达 将约50 mg的癌组织及癌旁组织冰上剪碎，液氮中研磨，Trizol法提取组织中总RNA，将总RNA反转录为cDNA，-20 ℃冰箱保存待测。HSP60正向引物序列5′-ATG CTT CGG TTA CCC ACA GTC-3′，反向引物序列：5′-AGC CCG AGT GAG ATG AGG AG-3′，NRF2正向引物序列5′-TCA GCG ACG GAA AGA GTA TGA-3′，反向引物序列5′-CCA CTG GTT TCT GAC TGG ATG T-3′，以GAPDH为内参，正向引物序列5′-GTG TAG ACC TTT TAG CCG ATG C-3′，反向引物序列:5′-GTG CCA GTA CAG TAG CAG TGG-3′。qPCR总反应体系20 μL，包括SYBR Green Master Mix 10 μL，正、反向引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。qPCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，变性、退火、延伸共45个循环。HSP60、NRF2 mRNA的相对表达量以2-ΔΔCt值法表示。

1.2免疫组织化学(IHC)检测HSP60、NRF2蛋白表达 将组织用10.0%组织固定液固定过夜，石蜡包埋后进行切片，切片厚度5 μm，60 ℃烤片1 h；切片入二甲苯两次，每次10 min；乙醇水化；微波炉抗原热修复；3.0%H2O2阻断30 min；5.0%羊血清封闭30 min；一抗37 ℃ 2 h(HSP60、NRF2单抗购自Abcam公司，货号ab190828、ab76026)；二抗37 ℃孵育2 h；DAB显色1 min；苏木素染细胞核30 s；梯度乙醇脱水，封片镜检。免疫组织化学评分根据阳性染色强度及染色面积评估。不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分；染色面积<25.0%为1分，25.0%～50.0%为2分，>50.0%为3分。染色强度评分乘以染色面积评分的为免疫组织化学评分。0～2分为阴性，3～9分为阳性。根据免疫组织化学评分，将89例患者分为低表达组(<4分)和高表达组(≥4分)。

2 结 果

2.1ccRCC癌及癌旁组织中HSP60、NRF2 mRNA表达比较 ccRCC癌组织中HSP60、NRF2 mRNA的相对表达量分别为0.483±0.112、1.725±0.285，癌旁组织分别为1.227±0.265、0.551±0.101，癌组织HSP60的相对表达量明显低于癌旁组织，差异有统计学意义(t=24.397，P<0.001)，而NRF2 mRNA的相对表达量明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(t=36.629，P<0.001)。见图1。

图1 癌组织与癌旁组织中HSP60、NRF2 mRNA表达量比较

2.2ccRCC癌及癌旁组织中HSP60、NRF2蛋白表达 癌组织中HSP60、NRF2蛋白主要表达于细胞质和细胞膜。ccRCC癌及癌旁组织中HSP60蛋白阳性表达率分别为84.3%(75/89)、100.0%(89/89)；NRF2蛋白表达阳性表达率分别为47.2%(42/89)、13.5%(12/89)。癌组织中HSP60蛋白阳性表达率明显低于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=15.195，P<0.001);癌组织中NRF2蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=23.925，P<0.001)。见图2。

图2 癌及癌旁组织中HSP60、NRF2蛋白表达(×200)

2.3ccRCC癌组织中HSP60、NRF2表达的相关性 Spearmen秩相关分析结果，ccRCC癌组织中HSP60与NRF2表达呈明显负相关(r=-0.520,P<0.001)。配对χ2检验结果：两个指标的关联性检验χ2=8.144,P=0.004，提示两个指标有密切关联；差异性检验χ2=19.105,P<0.001，提示两个指标水平相对变化很大，与其呈负相关关系有关。一致性系数Kappa为负值(Kappa=-0.233)，也与差异性明显及负呈相关关系互为佐证。

2.4ccRCC癌组织中HSP60、NRF2蛋白表达量与临床病理特征的关系 ccRCC癌组织中HSP60、NRF2的表达与肿瘤分期、远处转移及淋巴结转移有关(均P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理Furhman分级无关(均P>0.05)。肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、伴远处转移及伴淋巴转移的ccRCC癌组织中HSP60表达明显较低，NRF2表达明显较高(P<0.05)。见表1。

表1 ccRCC癌组织中HSP60、NRF2蛋白表达与临床病理参数的关系

2.5ccRCC癌组织中HSP60、NRF2蛋白表达与患者预后的关系 89例ccRCC患者随访3年，随访过程中4例失访，死亡27例，病死率为31.8%。HSP60低表达组3年生存率为41.5%(17/41)，明显高于HSP60高表达组的3年生存率93.2%(41/44)，差异有统计学意义(χ2=30.79，P<0.001)；HSP60低表达组平均生存时间为(23.5±6.1)个月，明显高于HSP60高表达组的平均生存时间(28.2±6.4)个月，差异有统计学意义(t=3.460，P<0.001)。NRF2低表达组3年生存率为95.2%(40/42)，明显高于NRF2高表达组的3年生存率41.9%(18/43)，差异有统计学意义(χ2=30.79，P<0.001)，HSP60低表达组平均生存时间为(29.1±6.2)个月，明显高于HSP60高表达组的平均生存时间(22.4±6.3)个月，差异有统计学意义(χ2=4.941，P<0.001)。

2.6单因素和多因素COX比例风险模型分析影响ccRCC患者生存预后的危险因素 以ccRCC透明细胞癌患者随访过程中的生存状态为因变量(1=死亡，0=存活，t=生存时间)，纳入年龄(赋值：1=≥60岁，0=<60岁)、性别(赋值：1=男性，0=女性)、Fuhrman分级(赋值：1=3+4级，0=1+2级)、肿瘤分期(赋值：赋值1=Ⅲ～Ⅳ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴结转移(赋值：1=有，0=无)、远处转移(赋值：1=有，0=无)、HSP60(赋值1=低表达，0=高表达)、NRF2(赋值1=高表达，0=低表达)为自变量。单因素COX分析结果表明，HSP60低表达、NRF2高表达、肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期的ccRCC患者生存预后差，多因素Cox回归分析结果ccRCC组织中HSP60低表达、NRF2高表达、肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期是影响ccRCC患者不良预后的独立危险因素。见表2、3。

表2 影响ccRCC患者生存预后的单因素Cox分析

续表2 影响ccRCC患者生存预后的单因素Cox分析

表3 影响ccRCC患者生存预后的多因素Cox分析

3 讨 论

肾癌是常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤。ccRCC是最常见的病理类型，约占所有类型的90.0%。ccRCC的治疗包括手术治疗、靶向治疗及免疫治疗等。早期ccRCC根治性手术患者就能获得满意的生存预后，但对于晚期ccRCC，患者预后较差。近年来新的药物如酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂及免疫检查点抑制剂等的临床应用，改善了转移性ccRCC患者的总体生存时间和无进展生存时间[8]。但在临床治疗过程中发现，部分ccRCC患者对药物治疗不敏感或治疗后发生耐药的现象，导致肿瘤进展[9]。深入研究ccRCC的疾病发生的机制，对于ccRCC临床诊断和治疗有重要意义。

热休克蛋白家族是细胞应激过程中产生的应激蛋白。生理条件下，该家族成员帮助蛋白质或多肽的正确折叠、降解和运输，其作为分子伴侣,发挥维持内环境稳定，协助细胞存活和抑制细胞凋亡等作用。HSP60是热休克蛋白家族成员之一，相对分子质量为60×103，作为一种线粒体伴侣蛋白，存在于细胞质或细胞表面。近年来发现，HSP60与肿瘤发生、发展关系密切，不同肿瘤中HSP60发挥不同的生物学功能。MARINO等[10]报道，肿瘤中HSP60作为一种促癌基因，抑制抑癌基因p53和caspase依赖的细胞凋亡，并通过与其他细胞内蛋白的相互作用激活核因子κB途径，促进细胞增殖。但有文献报道，HSP60在膀胱癌中发挥抑癌基因的作用，其能够通过增强肿瘤细胞的免疫原性，增强机体的抗肿瘤免疫杀伤功能，抑制肿瘤细胞的恶性进展[11]。目前，关于ccRCC组织中HSP60的表达研究报道较少。本研究中，ccRCC中HSP60表达明显降低，目前其机制尚不清楚，可能与非编码RNA对HSP60的表达调控有关。有文献报道，肿瘤细胞中miR-17能够直接结合HSP60 mRNA的3′非编码区，降低HSP60 mRNA的稳定性，抑制HSP60的表达，进而激活下游肿瘤坏死因子信号通路，促进肿瘤的发展[12]。本文进一步研究ccRCC中HSP60低表达的临床意义，结果发现，高肿瘤分期、远处转移及淋巴结转移的癌组织中HSP60的表达明显较低，表明ccRCC中HSP60的低表达促进肿瘤进展。TENG等[13]在体外细胞实验中证实，沉默ccRCC肿瘤细胞中HSP60的表达会破坏呼吸链复合体Ⅰ的完整性并触发过多的活性氧(ROS)的产生，ROS激活AMPK途径，促进ccRCC肿瘤细胞恶性增殖的同时，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，导致肿瘤进展。此外，ccRCC肿瘤组织中HSP60低表达患者远期生存预后较差，并且HSP60低表达是患者不良生存预后的独立危险因素，提示HSP60可作为新的判断ccRCC患者预后的肿瘤标志物，值得临床深入研究。

NRF2是定位于细胞核内的转录因子，参与血红素加氧酶-1(HO-1)、NADH氧化还原酶1(NQO1)等氧化应激通路中多种基因的表达[14-15]。有文献报道，NRF2在肿瘤的发生发展过程中起重要的调节作用，其作为一种原癌基因，参与激活血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子通路(PDGF)，促进肿瘤细胞的恶性增殖及转移[16]。本研究中，ccRCC癌组织中NRF2的表达升高，与以往研究结果一致[7]。ccRCC中NRF2表达上调的机制尚不清楚。有学者发现，正常细胞中NRF2受到Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)的泛素化调控，肿瘤中KEAP1的表达缺失或降低导致使NRF2的泛素化-蛋白酶体途径降解失调，从而增加了细胞中NRF2蛋白的量，NRF2易位至细胞核，然后激活其下游癌基因的表达[17]。本研究中，高肿瘤分期、远处转移及淋巴结转移癌组织中NRF2表达明显较高，提示ccRCC中NRF2促进肿瘤的发生、发展。NRF2的肿瘤促进作用与其对肿瘤代谢的影响有关。研究表明，NRF2能够诱导肿瘤细胞发生代谢重编程，NRF2激活戊糖磷酸途径关键酶基因的表达，促进肿瘤细胞中由葡萄糖的代谢转变为嘌呤核苷酸合成代谢，促进谷氨酰胺的生物学合成，谷氨酰胺作为肿瘤细胞重要的营养能量来源，维持肿瘤细胞的增殖能力[18-19]。本研究发现，ccRCC中NRF2高表达患者的生存预后较差，提示NRF2可能是判断ccRCC患者生存预后的分子标志物。多因素COX回归分析结果发现，NRF2高表达是ccRCC患者不良预后的独立危险因素。因此，本研究通过检测ccRCC癌组织中NRF2的表达，有助于对患者的预后进行初步评估，指导后续治疗和随访。

本研究通过相关性分析发现，ccRCC中HSP60与NRF2的表达呈负相关。蛋白质组学研究表明，在肾肿瘤细胞中沉默HSP60表达能驱动ccRCC的代谢重编程，激活NRF2介导的氧化应激反应，增强线粒体依赖性谷胱甘肽的生物合成，以促进肿瘤进展[13]。因此，ccRCC中HSP60可能对NRF2的表达存在调控关系，但二者的具体作用关系值得深入探索。

综上所述，ccRCC中HSP60表达降低，而NRF2表达升高，HSP60与NRF2表达呈负相关。HSP60及NRF2表达与ccRCC肿瘤分期、远处转移及淋巴结转移有关，二者共同参与ccRCC的发生、发展，是新的ccRCC预后判断的肿瘤标志物。但HSP60与NRF2间的机制及其在ccRCC中的临床意义有待深入研究。