HPLC分析头孢哌酮钠的杂质谱

2022-03-18唐浩张胜男周丽娜江芳吕慧敏张静

中国抗生素杂志 2022年2期

唐浩张胜男周丽娜江芳吕慧敏张静，2，*

(1 扬子江药业集团有限公司，泰州 225300；2 中国科学院大连化学物理研究所，大连 116000)

药品杂质谱控制是当前药物研发中的热点[1]。杂质谱分析可以更好地反映产品中杂质的来源，进而针对性地提出控制策略，更好地控制产品质量[2-3]。β-内酰胺类抗生素(如青霉素、头孢菌素等)是临床上最为常用的抗感染药物，其生产工艺及自身结构的特点决定了产品中有机杂质的种类复杂，其中不仅包括各种异构体和降解物[4-7]，还可以发生聚合反应形成各类聚合物杂质[8-10]，使得杂质谱分析更加困难。

头孢哌酮钠为第三代头孢菌素类抗生素，主要用于由敏感菌引起的呼吸系统、泌尿生殖系统感染等的治疗。《中国药典》2020年版采用高效液相色谱(RP-HPLC)法和凝胶色谱法分别对其有关物质和聚合物杂质进行控制，JP17、USP43、EP10.0仅采用RP-HPLC法控制其有关物质。鉴于凝胶色谱法对聚合物类杂质的分离专属性较差[9-10]，采用RP-HPLC法同时控制小分子杂质和聚合物杂质已经成为β-内酰胺类抗生素杂质谱控制的发展方向[11]。

本文对中国药典头孢哌酮钠有关物质RP-HPLC方法进行优化，通过提高有机相比例，增强色谱洗脱能力，建立了一个可同时控制头孢哌酮钠中小分子杂质和聚合物杂质的新方法；并利用质谱分析手段，对两个新未知杂质的结构进行了推测。

1 仪器与试药

1.1 药品与试剂

头孢哌酮对照品(批号130420-201105，含量为93.8%)、头孢哌酮杂质A(批号130428-201605，含量为98.1%)、头孢哌酮杂质F(批号130412-200902，含量为100.0%)购自中国食品药品检定研究院；头孢哌酮杂质B(批号PN5254-IMP-B-180719，含量为95.8%)、头孢哌酮杂质C(批号PN5254-IMP-C-170922，含量为99.8%)购自药渡公司；头孢哌酮杂质D(批号1530-014A4，含量为95.0%)购自TLC公司；头孢哌酮杂质E(批号151203，含量为98.6%)购自Molcan Corporation公司；头孢哌酮钠原料药(批号8021HK81D、8022HK81D、8023HK81D )购自齐鲁安替制药有限公司；头孢哌酮钠原料药(批号11C0171810002、11C0171810005、11C0171810006)购自山东罗欣药业有限公司；色谱级乙腈购自美国默克公司；分析纯三乙胺、冰醋酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠购自国药化试有限公司；超纯水由Millipore纯水仪制备。

1.2 仪器

Agilengt 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦有限公司)，Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，XP205十万分之一天平(美国梅特勒公司)，SCIEX QTRAP 4500三重四级杆质谱仪(美国AB Sciex公司)。

2 方法

2.1 色谱条件与系统适用性

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐使用Agilent Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm或效能相当色谱柱)，流动相A：三乙胺醋酸溶液(取三乙胺14 mL与冰醋酸5.7 mL，加水稀释至100 mL，摇匀，取1.2 mL与880 mL水混匀，并用冰醋酸调节pH值至2.5)，流动相B：乙腈，流速：1.0 mL/min，紫外检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样量：30 μL，梯度洗脱程序和LC-MS色谱条件详见表1～2。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

表2 LC-MS 色谱条件Tab.2 LC-MS chromatographic conditions

2.2 溶液的配制

2.2.1 供试品溶液

取头孢哌酮钠适量，精密称定，加少量磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾1.0 g和磷酸氢二钠1.8 g，加水1000 mL使溶解，即得)溶解，再用稀释剂[流动相A-乙腈(91:9)]定量稀释制成约含2 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2 对照溶液

精密量取“2.2.1”项供试品溶液1 mL，置200 mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 混合杂质对照品溶液

精密称取头孢哌酮杂质A对照品和头孢哌酮杂质C对照品各适量，加少量乙腈溶解，超声3 min，再用稀释剂定量稀释制成每1 mL含头孢哌酮杂质A和头孢哌酮杂质C分别约为30 μg和10 μg的溶液，即得。

2.2.4 系统适用性溶液

分别取头孢哌酮对照品和头孢哌酮各杂质对照品适量，用稀释剂溶解并稀释制成每1 mL含头孢哌酮杂质E、头孢哌酮杂质D、头孢哌酮杂质C、头孢哌酮杂质A、头孢哌酮、头孢哌酮杂质F、头孢哌酮杂质B分别约为10μg、10 μg、10 μg、30 μg、2 mg、10 μg和10 μg的溶液，即得。

2.3 方法验证

参考中国药典通则《9101分析方法验证指导原则》对新建立的分析方法进行验证。

2.3.1 系统适用性与专属性

取空白溶液(稀释剂)、供试品溶液、系统适用性溶液，分别注入色谱仪，空白溶液应不干扰测定，系统适用性溶液各色谱峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5。

利用强制降解试验进一步验证方法的专属性。取头孢哌酮钠约100 mg，共6份，分别进行不破坏、固体光照(4500±500 Lx，7 d)、固体高温(60℃，7 d)、氧化(0.3%双氧水5 mL，室温放置4 h)、酸(0.01 mol/L HCl，室温放置25 h)、碱(0.01 mol/L NaOH，室温放置10 min)破坏处理后，用稀释剂溶解并稀释制成2 mg/mL的溶液；分别精密量取30 μL注入色谱仪，采用二极管阵列检测器( DaD)进行紫外扫描，扫描范围为200～400 nm波长。

2.3.2 线性范围

分别精密称取头孢哌酮、杂质A、B、C、D、E和F各适量，配制成LOQ、限度浓度40%、80%、100%、120%、200%和400%的系列混合对照品溶液，进样测定，分别记录头孢哌酮及各杂质的色谱峰面积。将峰面积(A)与各自的质量浓度(C)作线性回归，计算头孢哌酮以及各杂质的线性方程。

2.3.3 检测限(LOD)与定量限(LOQ)

精密称取头孢哌酮对照品和杂质A、B、C、D、E、F对照品各适量，逐步进行稀释，进样，信噪比的10倍值作为各杂质的定量限，信噪比的3倍值作为各杂质的检测限。

2.3.4 仪器精密度

精密吸取30 μL混合杂质对照品溶液，连续进样5针，用各杂质峰面积的RSD表征仪器的精密度。

2.3.5 重复性

取头孢哌酮钠适量，按“2.2.1”和“2.2.2”项方法平行制备6 份供试品溶液和对照溶液，分别进样30 μL测定，按加校正因子的主成分自身对照法测定各样品中杂质含量的RSD。

2.3.6 中间精密度

由不同的分析人员，使用不同的仪器和不同的色谱柱在不同的日期进行试验。按“重复性”项下方法对相同批次头孢哌酮钠进行分析，计算6份供试品中各杂质含量的RSD。

2.3.7 准确度

精密称取已知杂质含量的供试品约22 mg，分别置于9个10 mL量瓶中，分别加入杂质A、B、C、D、E和F适量，制成含各杂质约为限度浓度40%、100%和200%的溶液，测定其含量，计算回收率。

2.4 校正因子测定

按“2.3.2”项方法，分别采用2台仪器系统由不同的分析人员在不同的时间做2组线性，按标准曲线法计算各已知杂质的相对校正因子[12]。

3 结果与讨论

3.1 方法建立

头孢哌酮钠RP-HPLC有关物质分析方法在ChP2020、EP10.0、BP2020和JP17中均有收载，各方法均采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；以三乙胺醋酸液-乙腈为流动相，等度洗脱；检测波长为254 nm；仅在供试品浓度、柱温等存在差异。该色谱系统对头孢哌酮钠中的已知杂质(杂质A、B、C、D、E和F)可以进行有效的控制，但不能检测聚合物类杂质。鉴于聚合物类杂质在RP-HPLC色谱系统中通常具有更长的保留值[9-10]，以ChP2020为基础，采用梯度洗脱，利用已知杂质进行色谱峰的定位；逐步提高流动相中有机相的比例增强洗脱能力，保证强保留杂质被洗脱；对头孢哌酮钠有关物质RP-HPLC分析方法进行了优化。新建立的分析方法不仅可以检出各国药典中所有收载的已知杂质(杂质A、B、C、D、E和F)，且在杂质B后相对头孢哌酮峰保留时间为1.5～2.5处发现两个新的未知杂质(图1)。

图1 新优化的头孢哌酮钠有关物质RP-HPLC分析方法色谱图Fig.1 Chromatograms of related substances of cefoperazone sodium by the optimal RP-HPLC

3.2 对新未知杂质的结构推测

采用LC-MS方法对新发现的未知杂质进行质谱分析。在未知杂质1色谱峰的+ESI图中存在m/z679.51130、m/z717.46758的准分子离子峰(图2a)，推测分别为[M+H]+和[M+K]+峰，提示该杂质的分子量为678 Da；其可能结构见图2b(结构推测过程略)。

图2 未知杂质1的+ESI图(a)和可能结构(b)Fig.2 +ESI diagram(a)and possible structure(b)of unknown impurity 1

未知杂质2 色谱峰的+E S I 图中存在m/z792.15286、m/z830.16803的准分子离子峰(图3a)，推测分别为[M+H]+和[M+K]+峰，聚合物1杂质的(a)+ESI质谱图和(b)可能结构提示该杂质的分子量为791 Da；其可能结构见图3b(结构推测过程略)。根据头孢菌素已知的聚合反应机理，母核羧基可以作为活性基团与另一分子的3位侧链发生聚合反应[13]，该杂质可能为合成过程中头孢哌酮氧化物与7-ACA的3位侧链反应产物。

图3 未知杂质2的+ESI图(a)和可能结构(b)Fig.3 +ESI diagram(a)and possible structure(b)of unknown impurity 2

冀峰等[8，13]采用在线体积排阻色谱-反相液相色谱-飞行时间质谱法对注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠中头孢哌酮聚合物杂质进行了分析，推测出了2对闭环二聚物的可能结构(分子量分别为1174和1290 Da)，并发现一个分子量为760 Da的杂质。但实际样品中未能检测到文献报道的头孢哌酮二聚体，提示头孢哌酮钠本身不易发生聚合反应，或形成的二聚体稳定性较差。鉴于未知杂质2在实际样品中存在，且在各种加速实验中不增加(表3)，提示其可以作为合成过程中头孢哌酮的指针性聚合物杂质。

3.3 方法验证

专属性：在酸、碱、氧化及高温强制降解条件下，头孢哌酮钠均有不同程度的降解(表3)，对各降解样品进行分析，主峰与杂质峰的分离度均大于1.5(图略)，主峰纯度角均小于纯度阈值，质量平衡均在90%～110%之间(表4)。

表3 降解杂质汇总表Tab.3 Summary of impurities of stress conditions test

表4 强制降解实验结果汇总表Tab.4 Summary of experimental results of stress conditions test

线性：头孢哌酮以及各杂质在各自的测定范围内线性关系良好(表5)。头孢哌酮、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F的检测限(S/N=3)分别为9.06、1.86、8.11、0.62、0.52、0.54和10.05 ng；定量限(S/N)分别为18.12、18.60、16.22、2.05、1.75、18.16和20.10 ng，连续进样6针峰面积的RSD分别为1.5%、0.4%、2.1%、5.8%、0.8%、2.5%和4.3%。

表5 头孢哌酮及各杂质标准曲线及线性范围Tab.5 Stan Dard curve and linearity range of cefoperazone sodium and the impurity

仪器精密度：混合杂质对照品溶液连续进样5针，头孢哌酮杂质A峰面积RSD为0.5%，保留时间RSD为0.2%；头孢哌酮杂质C峰面积RSD为0.2%，保留时间RSD为0.1%。重复性：分别测定6份供试品，杂质A的含量均为0.26%，杂质B的含量均为0.12%，杂质C的含量均为0.15%，最大未知单杂含量均值为0.11%(极差为0.03%)，新未知杂质1含量均为0.11%，新未知杂质2含量均值为0.07%(极差为0.02%)，其他总杂含量均值为0.25%(极差为0.05%)。中间精密度：分别测定6 份供试品，杂质A的含量均值为0.28%(极差为0.01%)，杂质B的含量均值为0.12%(极差为0.01%)，杂质C的含量均为0.15%，最大未知单杂含量均值为0.12%(极差为0.01%)，新未知杂质1含量均为0.10%，新未知杂质2含量均值为0.05%，其他总杂含量为0.28%(极差为0.05%)。

供试品溶液放置12 h，各已知杂质及未知杂质均无明显变化；对照溶液中12 h内头孢哌酮峰面积的变化RSD为0.12%，即供试品溶液及对照溶液在12 h内稳定。采用标准加入法评价各杂质测定的准确度(表6)。各浓度水平杂质的回收率均在90%～108%之间，回收率RSD均小于10.0%。

表6 头孢哌酮及各杂质回收率结果(%)Tab.6 Recovery of cefoperazone sodium and the impurity(%)

调节流动相pH2.5±0.1、柱温为30℃±2℃、流速为(1.0±0.1)mL/min，评价方法的耐用性。在上述条件下各杂质峰之间、各杂质峰与主峰之间的分离度均良好，主峰及各杂质的保留时间有变化，但各杂质相对于主峰的相对保留时间无明显变化，理论塔板数及拖尾因子均符合要求。

综上所述，新建立的头孢哌酮钠有关物质分析方法，具有良好的专属性、重现性、准确性和耐用性，可以满足有关物质质控的需要。

3.4 校正因子

对头孢哌酮钠已知杂质校正因子的测定结果见表5。当校正因子不在0.9～1.1范围内时，采用杂质对照品外标法定量是理想的方法，采用加校正因子的主成分自身对照法定量，较主成分自身对照法定量可得到更准确的定量结果。中国药典2020年版对头孢哌酮杂质A(校正因子为0.86)和杂质C(校正因子为0.40)采用外标法定量，但对头孢哌酮杂质B、杂质D、杂质E、杂质F(校正因子分别为0.86、1.14、0.77和1.19)采用主成分自身对照法定量，建议引入校正因子提高检测的准确性。

3.5 样品测定

按新建立的方法，测定齐鲁安替制药有限公司的头孢哌酮钠(批号：8021HK81D、8022HK81D、8023HK81D )和山东罗欣药业有限公司的头孢哌酮钠(批号：11C0171810002、11C0171810005、11C0171810006)样品中的有关物质(表7)，结果可见，国产样品中普遍存在杂质A、杂质B、杂质C、新未知杂质1和新未知杂质2，也进一步提示利用未知杂质2杂质作为合成工艺中的指针性聚合物杂质控制头孢哌酮工艺是可行的。