刘小刚 李甜 张舵

[摘要]耳廓重建主要是为了治疗先天性小耳畸形、外伤等造成的耳廓畸形或缺损，由于耳廓独特的形态与精细的生理结构，使得耳廓重建一直都是临床极具挑战性的治疗手段之一。自体肋软骨移植与人工支架置入是耳廓重建的常见方法，而软骨组织工程的出现，给耳廓重建带来了新的发展。其中选择合适性能的支架材料是研究热点之一，本文拟结合国内外研究进展，对耳廓重建的三种类型、不同软骨组织工程支架的特点以及耳廓支架面临的挑战与3D打印应用等内容综述如下。

[关键词]组织工程支架;耳廓重建;软骨细胞;先天性小耳畸形;3D打印

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）02-0161-05

Research Progress of Tissue Engineering Scaffold in Auricle Reconstruction

LIU Xiaogang， LI Tian， ZHANG Duo

（Department of Plastic and Aesthetic Surgery， the First Hospital of Jilin University， Changchun 130000， Jilin， China）

Abstract： Auricle reconstruction is mainly to treat auricle deformities or defects caused by congenital microtia， trauma， etc. Due to the unique shape and fine physiological structure of the auricle， auricle reconstruction has always been a clinically challenging treatment one of the means. Autologous costal cartilage transplantation and artificial stent implantation are common methods of auricle reconstruction， and the appearance of cartilage tissue engineering has brought new developments to auricle reconstruction. Among them， choosing a suitable stent material is one of the research hotspots. This article intends to combine the progress at home and abroad to investigate the three types of auricle reconstruction， the characteristics of different cartilage tissue engineering stents， the challenges faced by the auricle stent， and the 3D printing applications summarized as follows.

Key words： tissue engineering scaffold; auricle reconstruction; chondrocytes; congenital microtia; 3D printing

耳廓重建大多是為了治疗先天性小耳畸形、外伤等造成的耳廓畸形或缺损，这些疾病不仅对患者的身心健康造成极大的危害，也增加了临床治疗的挑战性。其中，先天性小耳畸形（Microtia）是具有代表性的疾病，致病原因可能与遗传、胚胎发育不良等相关[1]。据报道，Microtia在全世界的平均发病率为2.06/10 000[2]，在中国为3.06/10 000[3]。

自体肋软骨移植与人工支架置入，是耳廓重建常见的方法。随着组织工程的快速发展，软骨组织工程逐渐成为优化耳廓重建技术的突破口。组织工程是一门结合生物医学和材料工程学等学科的交叉学科，主要为了研究出能够改善机体形态与功能的生物替代品。近年来，组织工程在血管、神经、骨再造等领域均有发展，同时在耳廓重建中的探索也有极大的进展，1997年，曹谊林等[4]首次报道在裸鼠体内成功培养出了具有三维结构的人耳廓形态的组织工程软骨，这进一步激起了学者们对软骨组织工程应用于耳廓重建的兴趣。但是支架材料种类繁多，选择合适的耳廓支架尤为重要，它不仅能为种子细胞提供新陈代谢的场所，而且也能为细胞调节因子提供结合位点，尤其是三维多孔支架的出现，为耳廓软骨组织的形成和特异性细胞外基质的产生提供合适的环境[5]。因此，本文拟对耳廓重建的三种类型、不同软骨组织工程支架的特点以及耳廓支架面临的挑战与3D打印应用等内容综述如下。

1  耳廓重建

1.1 自体肋软骨移植：自体肋软骨移植最早开始于1959年，Tanzer等[6]应用自体肋软骨雕刻成耳支架，使耳廓形态得到了良好的塑造。在此基础上，Brent等[7]将该术式优化成四期，重建时间缩短至3个月，术式安全可靠，但步骤较多，Nagata等[8]遂将其整合后提出二期重建的方法：①自体肋软骨取出并雕刻置入，同时耳垂转位;②掀起耳廓以重建颅耳角，创面游离植皮。但对于耳后皮肤少、低发际线患者效果明显不佳，为了解决该问题，庄洪兴等[9]结合皮肤扩张法，分为三期进行：①扩张器置入;②扩张器取出，同时获取、雕刻及植入自体肋软骨;③耳屏、耳甲腔等塑形。相比Nagata法也大大减少了耳廓支架暴露与感染的风险。自体肋软骨通常选自右侧第6～8肋，对患者年龄有一定的要求，5～6岁时耳廓可达到成人的80%～90%[10]，年龄太小肋软骨数量不够，因此，一般6岁后可进行手术[11]。此方法由于生物相容性良好的巨大优势而广泛应用于临床，但对于术者的雕刻技术要求较高，胸廓畸形与气胸等并发症时有发生[12]。

1.2 人工支架置入：多孔高密度聚乙烯（商品名Medpor），是临床上主要应用的人工支架，一种高分子复合材料，塑形性好，加热后可切割焊接，其多孔隙有利于细胞增殖以及微血管长入，同时具有低排异性、无毒性。支架结构一般含有“Y”形耳基和“C”形耳轮两部分，术前依据健侧耳大小进行制作，之后应用带血管蒂的颞浅筋膜瓣覆盖Medpor支架，由于儿童的正常耳生长性，支架可适当放大。与自体肋软骨植入相比，消除了获取自身肋软骨的痛苦与伤害，也降低了手术的难度，明显缩短了手术时间[13]，同时可以不考虑肋软骨的量与骨化问题，手术时间可以提前到患者3岁时进行，通常一期手术即可[12]。但是Medpor材料质地较硬，柔韧性差，植入后通常存在支架外露、断裂、感染等问题[14]，为了弥补皮瓣的不足，有学者提出在患侧乳突区置入皮肤扩张器，二期取出扩张器后再置入Medpor，用扩张的皮瓣覆盖[15]。Ali等[16]提出通过颞顶筋膜瓣和全层皮肤移植，以充分覆盖Medpor支架，来降低挤压率和感染率，以上优化措施使并发症发生率得以降低，通常在1%～5%[17]。

1.3 软骨组织工程：为了获得更适宜的耳廓重建方法，不仅生物相容性好而且损伤小。二十世纪九十年代，软骨组织工程的出现，给耳廓重建的发展带来了新的生机。软骨组织工程是组织工程的一种发展方向，将种子细胞如软骨细胞等体外培养，种植于生物相容性良好、可降解的支架材料中，最终置入形成的组织工程化软骨以修复软骨缺损。自曹谊林等[4]首次报道人耳廓形态的组织工程软骨以来，软骨组织工程应用于耳廓重建的技术得到了巨大发展。Zhou等[18]将体外培养的组织工程软骨应用于人患耳处，使得小耳畸形患者获得了良好的耳廓形态，这是耳廓软骨组织工程从基础实验走向临床应用的新发展。同时，邢飞等[19]提出原位组织工程，即不采用种子细胞体外培养，主要利用支架材料的理化性质来募集自体细胞至缺损部位进行修复，但是支架材料如何更好地募集细胞的问题亟待解决。总之，软骨组织工程应用于耳廓重建仍需不断的探索与优化，其中对于支架材料的选择是研究的必要环节。

2  软骨组织工程支架

2.1 理想的支架特点：理想的软骨组织工程支架需满足以下特点。①具有良好的生物相容性，对种子细胞无毒性及排斥反应;②具有良好的生物可降解性甚至降解可调节性;③具有良好的表面活性，有利于细胞黏附与扩增;④具有良好的三维孔隙结构，有利于营养的运输与代谢[20]，当孔径和孔隙率越大机械强度越差，孔径越小又容易堵塞，阻碍营养物质的扩散与代谢产物的排出[21]，Zopf等[22]实验表明，球型微孔优于不规则形状的微孔;⑤具有良好的机械强度与可塑性，耐磨损耐支撑，并能维持一定的软骨形态长期存在，因此，力学性能应接近于正常的耳廓软骨，而弹性模量是反应力学性能的重要指标，正常的耳廓软骨弹性模量平均为（1.66±0.63）MPa[23-24]。近年來，新型软骨组织工程支架不断优化，从天然生物材料逐渐向人工合成材料以及复合材料等方向发展。

2.2 现实的支架特点

2.2.1 天然生物材料：天然生物材料是自然条件下生成的材料，具有生物相容性良好、可降解、来源广泛和成本小等优点，但是机械强度较差、降解快。常见有胶原、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、细菌纳米纤维素以及脱细胞支架等。

胶原是细胞外基质中的重要组成部分，广泛存在于哺乳动物的皮肤、软骨、肌腱和韧带等结缔组织中，具有支撑、保护的作用。载入胶原支架的耳廓软骨细胞在体外培养2周后移植到体内可发现软骨样组织[25]。之后，Cohen等[26]将细胞-支架复合物植入裸鼠体内长达6个月，仍可见到软骨样组织的存在，说明胶原支架具备一定的长期稳定性。将骨髓间充质干细胞（BMSC）放在软骨细胞生长过的培养基中进行诱导培养，再结合胶原支架，同样证实了此改良方法的成功性[27]。明胶是将胶原部分水解得到的一类可降解的、生物相容性良好的材料，当明胶海绵支架结合超过100 μg/cm3的碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）时，在促进b-FGF缓慢释放的同时有助于组织工程耳廓软骨的形成[28]。海藻酸盐是比较常用的软骨组织工程天然支架材料，无毒害作用，主要是从海藻中提取，与钙离子接触即可形成水凝胶。尽管海藻酸盐具有良好的生物相容性与多孔结构，但是在体内降解不稳定，后来，Leslie等[29]通过加入海藻酸盐裂解酶，得到可降解、可注射的海藻酸盐水凝胶。将种子细胞换成脂肪干细胞，结合海藻酸盐微球在兔耳缺损模型中也能证实软骨样组织的形成[30]。壳聚糖是自然界中广泛存在的几丁质通过脱乙酰化得到的，与软骨细胞外基质糖胺聚糖有相似的结构，具备较好的生物相容性和可降解性，但单纯应用机械强度及韧性差，多与其他材料复合使用。细菌纳米纤维素（BNC）是一种由几种细菌共同作用产生的多糖，类似于三维胶原网络，具有多孔性，孔径为70～140 nm，易结合水成水凝胶，还具有较高的机械强度、结晶度，其中含17%BNC的水凝胶，力学强度和耳廓软骨相似，异物反应小，但制备较复杂需去除内毒素[31]。脱细胞支架是通过去除组织中的细胞成分得到的细胞外基质，生物相容性良好并且可降解。软骨脱细胞支架[32]，具有类似软骨细胞外基质的结构和分子完整性，甚至基质的超微结构也能得到保留，并且具有促进软骨形成的潜力。弹性软骨细胞在体外培养可能会失去形成弹性纤维的能力，而通过去细胞化制备出天然的耳廓软骨脱细胞支架，可以保留弹性纤维，并且发现在该支架上培养的BMSC能够向软骨分化[33]。研究表明，在不添加外源性生长因子的情况下，使用自体甚至异体BMSC来源的脱细胞支架，都能在体外促进BMSC向软骨细胞分化[33-34]。与人工合成的长效可注射材料相比，脱细胞支架异物反应较少，可作为另一种长期可注射的填充材料[35]。为了进一步提高材料的耐用性，Lin等[36]研究出小肠黏膜下层脱细胞支架，除了用于血管、肌腱和膀胱等组织再生的研究外，当载入脂肪干细胞体内培养12个月，可形成血管化的类似耳廓的软骨样组织。

2.2.2 人工合成材料：人工合成材料是天然材料经过人为的物理化学等方法加工制得的高分子聚合物。具备良好的可塑性和机械强度，并且生产重复性好。但这些聚合物在生物学上通常是惰性的[32]，生物相容性普遍不如天然生物支架，降解后的酸性产物，也会改变细胞增殖分化的微环境[37]。目前，常见的人工合成材料有高密度聚乙烯（ Medpor）、聚己内酯 （poly-caprolactone，PCL）、聚羟基乙酸（ poly-glycolic acid，PGA）等。

聚乙烯按抗拉强度分低、高、超高三个不同等级，高密度聚乙烯Medpor作为一种无机疏水材料，主要用于面部整形手术。Medpor具有良好的生物相容性、耐久性、可塑性和不可再吸收性，孔径为40～200 μm[12]，孔隙率约50%，单独作为人工支架置入时，广泛应用于耳再造。但是材质偏硬，杨氏弹性模量为227～307 MPa，远大于正常耳廓软骨的机械性能[38]，因此容易出现支架外露等并发症。另外，Medpor也可用作模型，结合纤维蛋白凝胶及耳廓软骨细胞，置入体内能够形成人耳廓形状的软骨样组织。PCL是一种生物可吸收类型的聚合物，结合3D打印技术可构建成耳廓形状[39-40]。Nakao等[41]将小耳畸形患者的残耳软骨细胞和纳米级PGA支架结合在一起，发现在裸鼠皮下存活时间可长达40周，并且生成的新软骨特征与正常耳廓软骨细胞来源的组织工程软骨非常相似。刘戈等[42]将人耳廓软骨与聚氨酯弹性体、Medpor进行力学性能比较，发现和Medpor相比，聚氨酯弹性体压缩弹性与软骨接近，是更为理想的人工耳支架材料，这对耳廓重建的术后安全性更为有利。

2.2.3 复合材料：复合材料是由两种或两种以上的物质以不同的形式、比例组合而成的材料，不仅能保持各自的优良性能，而且能通过互补获得单一材料不能达到的综合性能。尤其是人工合成材料与天然生物材料结合后，可以增加自身生物学功能，同时提高后者的机械性能[32]。

蚕丝-海藻酸盐复合支架，Sterodimas等[43]将耳软骨膜间充质干细胞与该复合支架共培养置入体内，发现复合物的形态大小、灵活性甚至组织成分与正常耳廓软骨相似，类似的天然生物材料之间的结合材料还有胶原蛋白-纤维蛋白混合凝胶[44]等。当耳廓软骨细胞结合纤维蛋白水凝胶覆盖在改良的耳状Medpor上，进行体内培养发现有软骨样组织形成，并且与对照组相比，未见明显感染及支架外露[45]。壳聚糖-聚乙烯醇-环氧氯乙烷混合水凝胶，在促进细胞生长和细胞外基质形成的同时，还具有良好的力学性能和生物学特性[46]。蚕丝-聚乙烯醇，是由50%的蚕丝和50%的聚乙烯醇（PVA）复合而成的水凝胶，具有较好的生物相容性和机械强度，置入大鼠体内6周后仍可见三维耳状的软骨样组织[47]，同样类型还有10%生物玻璃/聚合羟丁酸盐-羟戊酸酯[48]。对于海藻酸盐-聚己内酯复合材料[21]，该材料由外模PCL和内部海藻酸水凝胶组成，具有良好的力学性能及仿生环境，基于3D打印技术的PCL外模，孔径为300 μm，易于打印组装与降解吸收。Matzenauer等[22，49]将内部水凝胶换成透明质酸-胶原，在不使用外源性生长因子的情况下，将比例为5：1或10：1的脂肪干细胞和耳廓软骨细胞共培养后，置入体内也可见到组织工程软骨的形成[39]。脱细胞-海藻酸盐-聚乙烯醇-甲基丙烯酰复合材料，海藻酸盐和聚乙烯醇是一种具有生物相容性和生物降解性的聚合物，目前常用作组织工程的水凝胶支架[50]，结合脱细胞后利用细胞外基质可得到一种生物相容性与力学性能均良好的复合材料[32]。当脱细胞与甲基丙烯酸软骨素硫酸盐结合后，发现该复合材料具有良好的灵活性，并且可以通过调整水凝胶、脱细胞、种子细胞类型和播种密度促进耳廓软骨细胞的生长[51]。聚羟基乙酸-聚乳酸（PGA-PLA）复合支架，研究表明PGA比起PLA更适合细胞的黏附和增殖，但降解速度较快，两者结合后性能得到提高，体内置入载有耳廓软骨细胞的PGA/PLA复合支架，可见软骨样组织形成[52-53]，尤其是添加20%的PLA时更为显著[54]。

3  耳廓支架面临的挑战与3D打印应用

3.1 面临的挑战：面对不断更新的耳廓软骨组织工程支架，虽然在体内外实验中均能发挥重要的作用，不仅有组织工程化软骨形成，而且具有良好的耳廓形态与生物相容性，但是如何在种类繁多的支架材料中选择最为适合的耳廓支架，以下问题值得进一步研究：①如何协调好耳廓支架降解与软骨细胞扩增的关系，是对机械强度与生物相容性共同的考验;②软骨组织工程支架设计的主要原则是模拟细胞外基质的成分与结构特点[55]，需要从软骨细胞外基质的角度去评估与构建，未来纳米复合材料可能会成为新的研究方向;③选择合适的种子细胞与细胞因子，对于整个软骨组织工程系统来说同样重要，目前三种类型各有研究，统一的、持续性的实验研究或许能产生更大的进步;④绝大多数支架材料应用于小动物实验，例如置入到裸鼠背部皮下，这与临床埋置于乳突前紧张的皮肤下相距甚远，因此，合适的实验模型是验证支架能否具有合适机械强度的前提，这对后期应用于临床试验十分重要。

3.2 3D打印应用：耳廓重建是一种美学实践，需要个性化、立体化的设计，利用3D打印技术是近年来热门且高效的方式。随着以计算机辅助设计/计算机辅助制造（CAD/CAM）技术为代表的数字化技术的发展，三维扫描获取健侧耳廓参数可以形成数字化耳模，结合3D打印技术后，能够生产出高保真、复杂几何形状的解剖支架，应用于术前建模指导手术或者制作个性化外耳假体[56-57]。有学者模仿3D 打印耳模雕刻肋软骨[58]，形成了具有个性化的耳支架，这极大地提高了耳再造的术后效果，并缩短了手术时间。近年来，許多学者将3D打印的耳支架应用于软骨组织工程进行耳廓重建，Kajsa等[59]利用海藻酸纳米纤维素生物墨水对人软骨细胞进行三维生物打印用于软骨组织工程，并提出基于纳米纤维素的生物墨水是一种适用于活细胞3D生物打印的水凝胶。另外，3D耳支架能精细地控制微孔结构，为支架材料的塑形提供有力的技术支持，比如构建具有微型纤维结构的Ⅰ型胶原支架[53]以及常见的多孔隙PCL耳外模[22，49]。在优化支架材料的孔隙性以及力学性能的同时，也能对支架的结构进行调整，Lee等[40]通过构建两种不同类型水凝胶的PCL支架，可以得到耳廓软骨和不含软骨的耳垂这两种结构。He等[60]提出了一种熔断电流体的3D打印技术，通过调节移动速度和方向，可以打印出具有弯曲性和预定纤维方向或间距的多层三维PCL支架，这极大地促进了细胞的体外增殖和排列。Mannoor等[61]通过3D打印技术，结合生物细胞和电子纳米颗粒，打印出同时具有耳廓结构和声音传导功能的仿生耳，体现了单纯的耳廓外形重建已逐渐发展到兼具形态与功能的耳再造。

4  小結和展望

支架材料的发展是优化软骨组织工程的关键，给包括治疗先天性小耳畸形在内的耳廓重建带来了新选择，其中复合材料是耳廓软骨组织工程支架的研究主流，与3D打印技术结合后能够塑造出更加精确的耳廓外形。支架材料种类繁多，现有的研究多针对新型支架的研发，缺乏一套规范的评估标准，望引起更多学者的关注，尽管支架材料在耳廓重建中的研究和应用还面临着诸多挑战，但随着软骨组织工程技术的深入发展，有望结合3D打印技术获得可行的支架材料，并早日应用于临床造福于患者。

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[收稿日期]2020-05-06

本文引用格式：刘小刚，李甜，张舵.组织工程支架在耳廓重建中的研究进展[J].中国美容医学，2022，31（2）：161-166.

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