张学勇，简莹娜，朵红，马怡隽，付永，沈秀英，宋永武，才让周在，郭志宏

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016；2.青海刚察县畜牧兽医站，刚察 812300)

犊牛腹泻是犊牛生长期常见的疫病，是导致犊牛死亡最主要的原因之一，也是牛养殖业经济损失的重要原因[1]。导致犊牛腹泻的致病因素可以分为两大类：感染性因素和非感染性因素。感染性因素包括病毒、细菌、寄生虫等病原；非感染性因素包括环境因素、饲养管理、自身状况等[1]。当犊牛发生腹泻时，肠道液体吸收功能下降，阻碍小肠中液体的吸收，液体分泌功能增加，并导致体液大量进入肠道，引起大量体液丧失，腹泻使机体丢失大量的体液而快速脱水[2]。腹泻脱水过程中还会大量丢失机体必需的钠、钾电解质，导致体内蓄积代谢产生的酸，最终引起脱水、电解质丢失和酸中毒，这是导致犊牛腹泻致死的原因[2]。相关报道显示：美国犊牛死亡一半以上的原因就是犊牛腹泻；国内形势也比较严峻，犊牛腹泻导致的死亡量约占总犊牛死亡量的80%[1]。在犊牛发生腹泻治疗过程中，诊断确认腹泻的致病原很重要，但是采取有效措施预防脱水、纠正体内酸中毒和补充电解质也是减少犊牛死亡的关键所在。

隐孢子虫(Cryptosporidium)是世界上公认的引起人畜腹泻的重要寄生性原虫，牛感染的隐孢子虫有微小隐孢子虫(C.parvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)、瑞氏隐孢子虫(C.ryanae)和安氏隐孢子虫(C.andersoni)等，主要侵袭动物的胃肠道上皮细胞而引起宿主的腹泻[3]。A型牛轮状病毒(Group A Bovine Rotavirus,BRV)是引起新生犊牛腹泻的主要病原，BRV感染犊牛可使小肠绒毛变短，肠吸收功能受损，7日龄以内的犊牛感染率较高，发病率与病死率分别高达90%～100%和0%～50%，如发生与其他病原的混合感染，可导致犊牛发生更严重的腹泻和更高的死亡率[4]。贾第鞭毛虫(G.duodenalis)也是人兽共患寄生性原虫，引起自限性消化系统疾病，犊牛易感染贾第虫，尤其当免疫功能下降时犊牛更易感，如若引发继发感染，则会引起死亡率明显升高，贾第虫至少存在八个不同的遗传学基因型聚集体(A-H)[5]。

本研究通过对犊牛腹泻样品进行PCR分子鉴定，确诊引起犊牛腹泻的主要病原，针对病原合理采用对症对因治疗和辅助支持治疗方法进行全面有效的救治预防，以期为临床上有效防治犊牛腹泻提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1病料采集

在刚察县吉尔孟乡牧场，按照采样要求，对表现出腹泻症状的犊牛，观察粪便状态等再进行样品采集，粪便样品保存冰盒及时运至实验室进行分析。

1.2主要试剂仪器

509402086本次试验所用实验试剂如下：2×TransStart PCR SuperMix、反转录试剂盒、DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司，粪便基因组DNA提取试剂盒和病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，PCR引物合成及PCR产物测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成，Speed V-Diar4TM快速免疫层析检测试纸条购自法国Virbac公司，其他均为国产常规试剂。本次试验所用的主要仪器包括PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、离心机、微量移液器等。

1.3分子鉴定

509402087首先利用Speed V-Diar4TM快速免疫层析检测试纸条对样品进行初筛，再利用天根粪便基因组DNA提取试剂盒对粪样进行基因组的提取，具体的操作步骤参考试剂盒说明书进行，基因组DNA于-20℃中保存备用。同时，利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒对样本进行病毒基因组RNA的提取，操作步骤参考试剂盒说明书进行，利用反转录试剂盒合成cDNA，于-20℃中保存备用。鉴定用特异性引物见表1；以提取的基因组DNA和cDNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，反应体系(50.0μL)如下：PCR SuperMix 25.0μL，上下游引物(浓度10.0μM)各2.0μL，模板DNA3.0μL，补充水18.0μL；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s、退火40s温度见表1、72℃延伸1～2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。扩增后PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳(电压120V，时间35min)，电泳完成后在凝胶成像仪中观察结果并拍照。

表1 PCR分子生物学鉴定所用引物

1.4基因序列比较与进化分析

509402088PCR阳性产物测序委托金唯智生物科技有限公司完成，采用Sanger法进行双向测序。测序结果经过测序峰图分析校正后，在GenBank上采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法进行同源序列搜索，应用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在线软件进行核苷酸序列同源性的分析。利用MEGA 5.0软件采用邻接法(NeighborJoining)构建系统发育树，选择Kimura 2parameter模式，进行重复1 000次的自举检验，在遗传进化角度分析不同地区的多杀性巴氏杆菌和殊异支原体的亲缘关系及其进化特点。

2 结果

2.1试纸条检测结果

509402089Speed V-Diar4TM快速免疫层析检测试纸条能够检测四种病原：冠状病毒、轮状病毒、大肠杆菌和隐孢子虫，结果显示轮状病毒(见图1 A)和隐孢子虫为阳性(见图1 B)，其他病原均为阴性。

图1 免疫层析试纸条检测结果

2.2分子鉴定结果

基于细菌通用引物扩增出1500bp的目的片段(如图2 A)，经过测序BLAST分析后均为环境菌，非致病性细菌。基于隐孢子虫18S rRNA 基因进行PCR扩增出约587bp的目的片段(如图2 B)，测序分析均为瑞氏隐孢子虫(C.ryanae)。基于贾第鞭毛虫β-giardin基因进行PCR扩增出约515bp的目的片段(如图2 C)，测序分析均为Assemblage E型贾第鞭毛虫。基于艾美尔球虫ITS-1基因PCR扩增，未检测到目的片段(如图2 D)。基于轮状病毒通用引物和VP6基因特异性引物分别均扩增约383bp和927bp的目的片段，测序分析均为A型牛轮状病毒(Group A Bovine Rotavirus,BRV)。

图 2 PCR分子鉴定结果

2.3基因同源性分析

通过Clustal Omega软件的Multiple Sequence Alignment程序方法比较分析，结果如下：扩增测序的C.ryanae-GC的18S rRNA基因与参考序列中国株KY711520、MF074603/4、KP793012、KJ020908，巴西株KX929962，波兰株KC582860/55，日本株AB628202和法国株GU124625/4/3的C.ryanae同源性高达100.00%。扩增测序的G.duodenalis的β-giardin基因序列与参考序列中国株MK442898和挪威株GQ337973的G.duodenalis(Assemblage E型)同源性高达100.00%。扩增测序的轮状病毒VP6基因序列与参考序列中国株MK638874/ MK250428的BRV-VP6的同源性高达96.7%。

2.4基因进化树分析

分别利用C.ryanae的18S rRNA基因，G.duodenalis的β-giardin基因和轮状病毒VP6基因序列构建系统进化发育树(见图3，4和5)。结果显示：本研究鉴定的C.ryanae-GC株与中国株KY711520、MF074604、KP793012、KJ020908等的C.ryanae同源性关系近，聚成一大支(如图3)；鉴定的G.duodenalis-GC株与Assemblage E型各个参考株G.duodenalis聚成一支(如图4)；鉴定的牛轮状病毒与 A型 Bovine Rotavirus聚成一大支，与中国株MK638874/MK250428 A型Bovine Rotavirus聚成一小支(如图5)。

图 3 基于C.ryanae-GC的18S rRNA基因进化树分析

图 4 基于G.duodenalis-GC的β-giardin基因进化树分析

图 5 基于BRV-GC的VP6基因进化树分析

3 讨论

犊牛腹泻是犊牛生长期常见的疫病，也是养牛业经济损失的重要因素。本研究为了快速准确诊断犊牛腹泻病原，给出治疗方案，利用分子生物学进行传染性腹泻病原的分子鉴定诊断。

本研究首先通过试纸条预检测排除了大肠杆菌的感染，同时检测到了寄生虫性病原——隐孢子虫和病毒性病原——牛轮状病毒。再次，通过细菌通用引物的分子鉴定排除了细菌性腹泻病原的感染。同时，利用分子生物学方法鉴定到了另一个寄生虫性病原——贾第鞭毛虫。任冠静等[6]在陕西秦川调查犊牛隐孢子虫感染情况时发现，隐孢子虫总感染率16.8%，种类包括安氏隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和牛隐孢子虫；四川地区断奶前奶牛犊隐孢子虫感染率为14.4%，种类包括牛隐孢子虫、微小隐孢子虫、瑞氏隐孢子[7]；宁夏地区隐孢子虫的阳性检出率为25.20%[8]；新疆地区的隐孢子虫感染率16.0%，感染的有安氏隐孢子虫和微小隐孢子虫[9]；甘肃地区奶牛隐孢子虫感染率为1.8%[10]；青海地区牦牛隐孢子虫总感染率为2.53%，6月龄及其以内的犊牦牛的感染率6.25%，6月龄以上牦牛的感染率2.35%，种类包括瑞氏隐孢子虫和牛隐孢子虫，其中以瑞氏隐孢子虫为优势虫种[3]，这与本研究鉴定的流行虫种一致。

本研究鉴定感染牦牛犊牛的贾第鞭毛虫是E型贾第鞭毛虫。宁夏地区奶牛犊牛贾第鞭毛虫阳性检出率为4.72%[8]；甘肃地区奶牛贾第鞭毛虫感染率为0.1%[10]；四川部分地区断奶前犊牛贾第鞭毛虫总感染率为9.35%，且虫种均为集聚体E型[11]；青海省祁连地区牦牛贾第鞭毛虫总感染率为9.7%，且虫种也均为集聚体E型[12]；这些与本研究鉴定的贾第鞭毛虫种类结果一致。

本研究鉴定感染牦牛犊牛的轮状病毒为 A型牛轮状病毒。泽旺塔等报道四川若尔盖地区牦牛轮状病毒抗体阳性率为99.2%(ELISA方法)[13]；新疆南疆某规模奶牛场中牛轮状病毒抗体阳性率为15.69%(ELISA方法)[14]；新疆石河子等地区牛轮状病毒RT-PCR检测阳性率73.83%[15]；周芳等利用建立的RT-PCR检测方法对部分地区牦牛粪样本检测：阳性率结果如下西藏为60.00%、青海为95.00%、四川为85.19%、云南为90.00%[16]；可见牛轮状病毒感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因之一。

本研究通过分子生物学方法进行了犊牛腹泻病原的精确鉴定，可见病原多样复杂，所以当犊牛发生腹泻时，要及时准确诊断；同样，日常的管理与预防也非常重要。当犊牛发生腹泻时，对患病牛立即隔离对症治疗，及时补液防止脱水、纠正酸中毒和补充电解质。对于不同因素引起的犊牛腹泻，预防措施主要是加强牛群的科学饲养管理，针对怀孕母牛的营养：确保有足够的能量、蛋白质、矿物质和维生素；对犊牛饲养环境及卫生：保证牛圈舍干燥、清洁，保证圈舍采光通风，圈舍环境干净、清洁，将产犊区与越冬区分开(特设产犊区)，定期对圈舍、用具进行消毒，及时清理宿粪、尿液并无害化处理；新生犊牛的护理：注重新生犊牛的初乳饲喂，通过吸收初乳中的抗体获得对各种病原的免疫力。所以，我们要对病原性因素加以重视，不断加强饲养管理水平，预防腹泻疾病的发生；同样准确诊断病原也非常重要，这样才能为对因对症治疗提供科学依据。