贺敬霞，党艳妮，张笑笑，黄壮壮，王益民，张鑫，陈衍斌*

1.陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712042；

2.陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075

天麻Gastrodia elataBl.为兰科植物天麻的干燥块茎，具有息风止痉、祛风通络等作用，临床用于治疗癫痫、高血压、小儿惊风等病症，蜜环菌为蜜环菌属的寄生真菌，具有祛风通络、强筋骨等作用，用于治疗癫痫、佝偻等病症[1-2]。蜜环菌与天麻两者是共生且相互不可或缺的一部分，天麻通过蜜环菌中菌丝体获取营养，蜜环菌则寄生于天麻。据文献报道，目前天麻蜜环菌已分离鉴定出近百种化合物，包括嘌呤类、半倍萜类、有机酸、总黄酮、氨基酸等，具有调血脂、抗肿瘤、抗炎、抗惊厥等生理活性[3-4]。天麻蜜环菌作为天麻蜜环菌片、复方天麻蜜环菌片等中药制剂的主要原料，具有治疗眩晕、头痛、惊风癫痫、腰膝酸痛等作用。随着天麻蜜环菌用药广泛与常态化，其药品质量、药物疗效与用药安全等是需要关注的，故天麻蜜环菌质量标准的建立是非常必要的。目前已颁布天麻蜜环菌片的质量标准[5]，而天麻蜜环菌药材相关质量标准尚未建立，也未有测定蜜环菌中染料木素及麦角甾醇方法的相关报道，故本实验建立天麻蜜环菌薄层色谱鉴别方法，染料木素、麦角甾醇高效液相色谱法（HPLC）并测定其二氧化硫残留量，为天麻蜜环菌质量标准建立提供参考。

1 材料

1.1 仪器

e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；DHG-9140B 型恒温鼓风干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司）；SQP型电子天平［德国赛多利斯（北京）有限公司］；薄层色谱定量点样毛细管（天津市思利达科技有限公司）；KQ-800KDE 型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JT108-1RW型中药二氧化硫检测仪（菏泽市牡丹区俊藤电子仪器有限公司）；UPT-I-10T 型优普系列反渗透超纯水机（成都超纯科技有限公司）。

1.2 试药

30%过氧化氢溶液（天津欧博凯化工有限公司）；0.1%氢氧化钠滴定液（上海安谱实验科技股份有限公司）；盐酸（北京化工厂，分析纯）；硫酸（洛阳昊华化学试剂有限公司，分析纯）；甲酸（天津市河东区红岩试剂厂，分析纯）；G-硅胶薄层板（青岛海洋化工有限公司、青岛海浪化工有限公司）；甲基红、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）、香草醛（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；甲醇［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；对照品麦角甾醇（中国食品药品检定研究院，纯度≥96.2%，批号：111845-201604）；对照品染料木素（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：20130412）。

蜜环菌对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121244-201202）；天麻蜜环菌（神华药业公司，批号分别为20180918、20200921、20200922）。

2 方法与结果

2.1 天麻蜜环菌的薄层色谱鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取批号分别为20180918、20200921、20200922的天麻蜜环菌样品各1 g，分别置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚（60～90 ℃）10 mL，超声40 min（100 Hz，260 W），取出，滤过，滤液浓缩至约1 mL，作为供试品溶液。另取天麻蜜环菌对照药材1 g，同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法（通则0502）试验。

2.1.2 对照药材溶液的制备 同2.1.1项下方法。

2.1.3 薄层色谱条件 参照《中华人民共和国卫生部颁药品标准》天麻蜜环菌片薄层色谱鉴别法[5]，吸取上述2种溶液各5µL，分别点于同一羧甲基硅胶钠为黏合剂的G硅胶薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂，饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，见图1。

图1 天麻蜜环菌薄层鉴别图

2.1.4 优化后薄层色谱条件 照薄层色谱法，吸取以上各溶液5µL，分别点于同一羧甲基硅胶钠为黏合剂的G 硅胶薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（36.0∶8.0∶0.5）为展开剂，饱和30 min 后，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸显示剂溶液，在105 ℃烘约5 min，见图1。

由图1 可知，改进后薄层色谱相对应点分离度较好，且与前期对比有3个较明显的点出现。

2.2 二氧化硫残留量测定

2.2.1 3%过氧化氢配制 精密量取30%过氧化氢20 mL置具塞瓶中，后加入180 mL水，摇匀备用。

2.2.2 指示剂配制 精密称取甲基红12.5 mg 置于具塞瓶中，加入无水乙醇5 mL，超声助溶，配制撑质量浓度为2.5 mg·mL-1甲基红乙醇溶液，备用。

2.2.3 氢氧化钠溶液配制 精密吸取0.1 mol·L-1氢氧化钠滴定液10 mL 置于具塞瓶中，加水90 mL稀释，摇匀，配制成浓度为0.01 mol·L-1氢氧化钠溶液，备用。

2.2.4 盐酸溶液配制 精密吸取浓盐酸24.8 mL 置具塞瓶中，加水25.2 mL 稀释，摇匀，配制成浓度为6 mol·L-1盐酸溶液，备用。

2.2.5 二氧化硫测定 参考《中华人民共和国药典》2020 年版[6]，分别称定3 批蜜环菌样品各10 g，置三颈圆底烧瓶中，加水400 mL。打开回流冷凝管开关，将冷凝管上端口处连接橡胶导气管，置于100 mL 锥形瓶底部。锥形瓶内加入3%过氧化氢溶液50 mL 作为吸收液，使用前加入2.5 mg·mL-1甲基红乙醇溶液指示剂3滴，并用0.01 mol·L-1氢氧化钠滴定液滴定至黄色。开通氮气，调节气流约至0.2 L·min-1，打开封液漏斗使6 mol·L-1盐酸溶液10 mL流入蒸馏瓶，立即加热使三颈烧瓶内的溶液至沸（沸点设置为102 ℃，保持2 min），并保持微沸（99 ℃）90 min后停止加热。吸收液放冷后，置于磁力搅拌器上不断搅拌，用氢氧化钠滴定液滴定至黄色，持续时间20 s不褪，并将滴定结果用空白验证。空白为未加样品的水溶剂。按公式（1）计算供试品中二氧化硫残留量，不同批次二氧化硫测定结果见表1。

表1 不同批次蜜环菌二氧化硫残留量测定结果

式中A为供试品溶液消耗氢氧化钠滴定液的体积（mL）；B为空白消耗氢氧化钠滴定液体积（mL）；C为NaOH滴定液浓度（mol·L-1）；0.032为1 mL 氢氧化钠滴定液（1 mol·L-1）相当于二氧化硫的量（g）；W为供试品的质量（g）。

2.3 染料木素、麦角甾醇含量测定

2.3.1 溶液的制备

2.3.1.1 对照品溶液的制备 精密称定麦角甾醇、染料木素对照品适量，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，配制为质量浓度分别为368、490 μg·mL-1混合对照品储备液。

2.3.1.2 供试品溶液 称取天麻蜜环菌样品1 g，置具塞瓶中，加10 倍量80%乙醇，超声处理30 min（250 W，100 kHz），取出，滤过，备用。

2.3.2 色谱条件 参考文献［7］，通过试验确定最佳色谱条件，色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B）；梯度洗脱（0～10 min，50%A；10～20 min，50%～100%A；20～40 min，100%A）；检测波长：染料木素260 nm，麦角甾醇280 nm；体积流量：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL，得供试品及对照品色谱图，见图2。

图2 天麻蜜环菌色谱图

2.3.3 方法学考察

2.3.3.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液适量，逐倍稀释，并加甲醇定容至刻度线，摇匀，得系列浓度对照品，按2.3.2项下色谱条件测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，染料木素回归方程：Y=80 262X-345 092（r=0.999 5），表明在3.829～245.000µg·mL-1线性良好。麦角甾醇回归方程：Y=16 027X+39 452（r=0.999 8），表明在1.893～368.440 µg·mL-1线 性良好。

2.3.3.2 精密度考察 精密吸取混合对照品溶液，按2.3.2 项下色谱条件连续测定6 次，得染料木素、麦角甾醇对照品峰面积RSD分别为0.58%、0.93%，均小于2.0%。表明仪器精密度良好。

2.3.3.3 重复性试验 按2.3.1.2 项下方法，取同一批天麻蜜环菌样品（批号：20180918）平行制备6 份供试品溶液，按2.3.2 项下色谱条件测定，计算染料木素、麦角甾醇含量，并得其RSD 分别为2.80%、2.92%，均小于3%，该方法重复性良好。

2.3.3.4 稳定性试验 取供试品溶液，按2.3.2 项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，得染料木素、麦角甾醇峰面积的RSD 分别为1.30%、2.66%，均小于3%，表明样品及对照品溶液在24 h内较稳定。

2.3.3.5 加样回收率试验 称定天麻蜜环菌样品0.5 g，置于具塞瓶中，按当前样品含量100%比例加入染料木素、麦角甾醇对照品，按2.3.1.2 项下方法平行制备6份样品溶液，在2.3.2项下方法测定峰面积，计算加样回收率及RSD，得染料木素、麦角甾醇平均加样回收率分别为102.90%、101.29%，RSD分别为0.93%、1.62%，说明该操作方法良好。

2.3.4 不同批次天麻蜜环菌含量测定 称定3 批天麻蜜环菌样品各1 g，精密称定，按照2.3.1.2 项下制备样品溶液，在2.3.2 项下色谱条件下测定，结果见表2。

表2 不同批次蜜环菌质量分数

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别分析

本实验分别对展开剂（石油醚-乙酸乙酯-甲酸）、显示剂（1%硫酸乙醇、0.5%香草醛冰乙酸、1%香草醛硫酸）、温湿度（温度5～40℃，湿度15%～75%）进行考察，结果显示，采用石油醚-乙酸乙酯-甲酸（36.0∶8.0∶0.5）为展开剂、1%香草醛硫酸为显示剂，供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，斑点显示清晰，且该方法适用性较好，可用于天麻蜜环菌药材的鉴别。

3.2 二氧化硫残留量

传统中医药中，通常采用硫黄熏蒸中药材，以延长贮存时间，避免药材发霉腐败，而过量二氧化硫残留破坏人体正常的氧化作用与代谢，引起呼吸系统类疾病及产生不良反应，严重会产生急性中毒症状[8]。因此，各国对中药材的二氧化硫残留量制定了相关标准，《韩国药典》第10版要求残留量低于30 mg·mL-1，《日本药局方》第17版与《美国药典》第43版要求残留量低于50 mg·mL-1，《中华人民共和国药典》2020年版也对中药材二氧化硫的残留量进行限定，如山药低于10 mg·kg-1、牛膝不超过400 mg·mL-1[9]。目前，未有天麻蜜环菌二氧化硫残留量的相关标准。

通过本实验对各批次的天麻蜜环菌测定，得其二氧化硫残留量低于20 mg·mL-1，与传统硫黄熏蒸中药材不同，天麻蜜环菌通过培养基培养获得而未进行硫黄熏蒸。参考相关研究资料，探究天麻蜜环菌二氧化硫残留原因：1）药材自身含有的硫苷及硫衍生物在加热后降解而生成二氧化硫；2）在培养过程中，通过吸收培养液中的硫酸根，之后代谢而形成结合与流离态的亚硫酸根；3）植物通过气孔吸收大气中的二氧化硫，以及水中、土壤中的硫化物被植物吸收后，使其含有一定流离态和结合态的含硫成分[10-12]。结合天麻蜜环菌目前已知的化合物，如氨基酸类、有机酸类、多糖类，其中均未含硫元素及其硫衍生物。同时，其培养过程密闭，二氧化硫来源于空气几率较小，故猜测可能来源于内源性硫酸根，因在培养过程培养液中加入硫酸镁溶液后逐渐代谢产生亚硫酸根[13]。

3.3 染料木素、麦角甾醇含量测定

前期对不同提取溶剂：水、20%～80%乙醇、20%～100%甲醇进行考察，测定结果显示，当提取溶剂为水、20%乙醇、20%甲醇时，染料木素、麦角甾醇均未出峰，当提取溶剂为40%乙醇、40%甲醇、60%甲醇时未测出染料木素，当溶剂为80%乙醇时染料木素、麦角甾醇含量均达到最佳，故选用80%乙醇作为提取溶剂。同时，实验方法验证表明，采用HPLC 测定天麻蜜环菌中染料木素、麦角甾醇的方法操作简单、稳定性好、灵敏度高，可用于其质量标准的建立。