陈吉祥，尹海波，王丹，贾丁丁，贾春雷，程世赞

辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116000

辽宁省是龙胆的道地产区，为“辽药六宝”之一。龙胆作为中医临床常用药材，具有泻肝胆实火功效，需求量较大。市场上流通的龙胆主要源于栽培品。生态环境差异会导致龙胆有效成分含量不同，不同地区龙胆品质存在差异，研究龙胆在辽宁省内品质区划对其合理种植及品质提升非常重要。中药龙胆为龙胆科（Gentianaceae）植物龙胆Gentiana scabraBge、条叶龙胆G.manshuricaKitag.、三花龙胆G.trifloraPall.或滇龙胆G.rigescensFranch.的干燥根茎及根，前3 种主要分布在辽宁、吉林、黑龙江和内蒙古，商品名为“关龙胆”。通过实地调查发现，东北有大面积的种植龙胆，而辽宁省种植品种为龙胆G.scabraBge.，占“关龙胆”市场份额的80%以上，故本研究以辽产龙胆G.scabraBge.为研究对象。

中药龙胆功效丰富，1 种成分无法评价其质量，故选取环烯醚萜苷类成分龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷，龙胆多糖和龙胆碱5 种成分作为其品质评价指标。多糖具有抗病毒、调节免疫、抗氧化作用；獐牙菜苦苷在植物内生真菌和人体肠内菌作用下转化成龙胆碱发挥抗糖尿病作用；有研究猜测龙胆苦苷发挥作用也与龙胆碱的转化有关，故龙胆碱也作为龙胆品质评价指标[1]。

气候和环境因素（降雨量、温度、土壤类型、植被类型等）是影响物种分布的决定性因素，也决定了药材的产量和质量[2-3]。通过实地调查发现，不同引种地的龙胆产量和质量差异较大。冗余分析法（RDA）是多元回归分析的直接扩展，用于多变量响应数据建模[4]。RDA 的优点是可以检测环境因子、样地、化学成分三者之间的关系或两两之间的关系。本研究利用最大熵（MaxEnt）模型和ArcGIS 软件，对龙胆潜在适宜区进行分析，探讨其主要生态因子的适宜范围。深入分析环境因子与有效成分、有效成分与样地之间的关系，为基于某种化学成分含量的龙胆栽培区域选择和基于气候环境的龙胆资源开发提供参考依据，有利于推动龙胆的合理种植、提高药材的质量。

1 材料

1.1 样品

通过查阅《中国植物志》《辽宁植物志》等相关资料、实地调查和参考第四次中药资源普查数据库，发现在辽宁省内龙胆G.scabraBge.主要分布在辽宁省的东部地区，辽西没有发现野生及栽培龙胆。本课题组于2020 年赴本溪市南芬区、盖州市、桓仁县、宽甸县、清原县、西丰县、新宾县、岫岩县、庄河市等辽宁龙胆主要产区进行实地采样，共获取23 批样品，均为3 年生龙胆。由全球定位系统（GPS）定位仪和轨迹仪实时获取采样点经纬度、海拔等信息（表1）。样品经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为龙胆Gentiana scabraBge.。

表1 辽宁省龙胆样品信息

1.2 仪器

1260 型高效液相色谱仪［配备二极管阵列（DAD）检测器，美国Agilent 公司］；UV-5200 型紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；PT-35SL 型微量电子天平（华志电子科技有限公司）；KQ5200DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 试药

对照品龙胆苦苷（批号：R20O8F46237，纯度：98%）、獐牙菜苷（批号：P31M7F12286，纯度：98%）、獐牙菜苦苷（批号：Y25J10H91429，纯度：98%）、秦艽甲素（批号：X31O9L73842，纯度：98%）、α-D-无水葡萄糖（批号：M15M9E56052，纯度：99%）均购自上海源叶生物生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，默克股份有限公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 环境因子数据

环境因子数据来源于中药资源空间信息网格数据库（http://www.tcm-resources.com/）和采样地气象站，包括地形、土壤、温度、降水情况及综合气象数据。

2.2 化学成分的检测

采用参考文献［5］方法测定龙胆中环烯醚萜苷类成分龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷含量；龙胆碱采用参考文献［6］的方法进行含量测定；龙胆多糖采用参考文献［7］的方法，利用苯酚-硫酸法显色，491 nm处进行紫外-可见分光光度测定。

2.3 主成分分析（PCA）

主成分得分（ZF）是衡量质量的重要参数，得分越高，质量越好。利用SPSS 21.0 统计软件的主成分分析方法，通过降维和赋予权重把5 种化学成分指标转化为1 个新的独立综合指标，包含原始变量绝大部分信息，对龙胆的质量进行综合评价。把ZF 作为综合评价龙胆质量的标准，不但克服了确定权重不合理的缺陷，又可消除评价因子之间的相关影响[8-9]。

基于Kaiser-Harris 准则保留特征值＞1 的主成分，故保留2 个主成分，前2 个成分包含了原始5 种成分74.807% 的信息（表2）。第一主成分（F1）主要反应龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆碱的信息；第二主成分（F2）主要反应龙胆多糖的信息。ZF 反映了化学成分的协调程度[10-11]，在SPSS 中以2 个主成分因子得分各自的权重作为评估参数，计算公式为ZF=0.707 8F1+0.292 2F2。

表2 龙胆5种成分的主成分分析初始统计值

2.4 生态适宜性分析

基于采样点数据，利用MaxEnt 模型和ArcGIS软件相结合，得出龙胆分布概率。将转换格式后的经纬度信息与生态因子导入到MaxEnt 模型，参数设置随机测试比例为15%，最大迭代运算数为1×105次，其他参数为默认值。模型预测结果精度评价以受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）为指标，其越接近1 表示预测结果越可靠[12]。采用MaxEnt模型进行迭代运算，选取贡献率大，权重高的生态因子为影响龙胆适宜性分布的主要生态因子，最后分析生态因子响应曲线。

2.5 RDA

RDA 是一种结合回归和PCA 的方法，利用Canoco 5.0 软件进行分析。典型相关分析（CCA）是研究2 组变量之间关系的一种多变量统计分析方法，其基本原理是在每组变量中找出变量的线性组合，使其具有最大相关性，直到2 组变量之间的相关性被提取完毕[13-14]。以上过程在Canoco 5.0软件中自动进行。对环境因子，龙胆5 种主要成分（龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆多糖、龙胆碱）和ZF，以及样地三者之间的关系进行分析，找出最有代表性的环境因子，规划最优产区。

3 结果

3.1 龙胆主要有效成分含量测定及ZF

龙胆苦苷（C16H20O9）在《中华人民共和国药典》2020 年版中为中药龙胆定性定量鉴别中的指标性成分，不得少于2.0%[15]。运用2.2 项下方法测定有效成分质量分数（表3）。经测定，辽宁省内的龙胆龙胆苦苷含量全部符合要求，再次证明了辽宁省是龙胆道地产区，该产区所产龙胆质优效佳。运用2.3项下的方法计算ZF（表3）。

表3 龙胆中5种成分质量分数及ZF

3.2 分布区生态特征

采用AUC 进行生境适宜度分析模型计算结果精度评价，结果见图1。其训练集AUC为0.998，测试集的AUC 为0.994，表明龙胆生态适宜度的预测结果好，准确度高。

图1 龙胆生态适宜性分析ROC曲线

查阅《中国植物志》、实地调查和第四次中药资源普查数据库，现阶段种植龙胆及野生龙胆集中在辽宁东部。与预测结果相同，龙胆在辽宁东部分布概率最大，如抚顺市、丹东市、本溪市、铁岭市等，辽宁西部分布概率很小。根据MaxEnt模型计算分析的各生态因子在龙胆分布生境适宜度中所占权重可以看出，11 月降水量、11 月温度、土壤质地分类（USDA）、8 月降水量、最冷月最低温、土壤类型、海拔所占权重方差贡献率超过90%。通过分析主要环境因子响应曲线可以看出，影响龙胆适宜性分布的主要生态因子最适宜值范围。由图2 可以看出，海拔在0～1400 m 分布概率最高，如继续升高则分布概率急剧下降；最冷月最低温在-30～-10 ℃分布概率最高；8 月降水量在200～400 mm 分布概率最高，少于200 mm时分布概率明显下降；11月降水量在30 mm 左右分布概率最高，超过或不足30 mm 时分布概率下降；11 月温度在-10～5 ℃分布概率最高。土壤最适质地粉沙壤土，壤土；土壤最适类型为黑土、暗色火山灰土、石灰性黑土、铁质淋溶土。

图2 影响龙胆生长的主要环境因子响应曲线

3.3 RDA关系排序分析

RDA 排序图描述了有效成分和环境因子、有效成分和样地之间的关系（图3）。龙胆有效成分和ZF与环境因子的关系。箭头越长表示某一环境因子对龙胆有效成分含量的影响越大。可知最具有代表性的环境因子为经度，其次为坡度、年均温度、海拔、年均降水量、日照时数。

环境因子箭头连线和龙胆有效成分含量夹角表示某相关性大小，夹角＜90°为正相关、＞90°为负相关，夹角越小相关性越高。结果表明，獐牙菜苷与经度呈正相关，与坡度、年均温度、海拔、年均降水量、日照时数呈负相关，与经度相关性最大；獐牙菜苦苷与经度、坡度、海拔、年均降水量呈正相关，与日照时数和年均温呈负相关，与经度相关性最大；龙胆苦苷与经度、坡度、海拔、年均降水量呈正相关，与日照时数和年均温呈负相关，与坡度和海拔相关性最大；龙胆碱与经度、坡度、海拔、年均降水量呈正相关，与日照时数和年均温呈负相关，与坡度相关性最大；龙胆多糖与日照时数和年均温呈正相关，与经度、坡度、海拔、年均降水量呈负相关，与日照时数相关性最大。ZF 与经度、坡度、海拔、年均降水量呈正相关，与日照时数和年均温呈负相关，与经度相关性最大。

有效成分和样地之间的关系。通过线性排序图样地在有效成分含量箭头及其延长线的投影点可以看出，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和龙胆碱质量分数在5、6 号样地（桓仁县）丰度最高；獐牙菜苷质量分数在2 号样地（丹东市）丰度最高；龙胆多糖质量分数20 号样地（岫岩县）丰度最高。ZF 在5、6 号样地（桓仁县）丰度最高。

3.4 基于分布适宜性分析和RDA 分析的品质区划研究

基于MaxEnt 模型和ArcGIS 相结合的分布适宜性分析可知龙胆在辽宁省的适宜分布区主要包括抚顺市抚顺县、清原满族自治县、新宾满族自治县；本溪市本溪满族自治县、桓仁满族自治县；丹东市凤城市、宽甸满族自治县；鞍山市海城市、岫岩满族自治县；大连市庄河市；铁岭市开原市、调兵山市、铁岭县、西丰县、昌图县；营口市盖州市；辽阳市灯塔市、辽阳县；盘锦市盘山县。

RDA关系排序分析可知，ZF与经度、海拔、年均降水量呈正相关，在适宜龙胆分布的前提下，数值越大，有效成分含量越高，品质越好。故运用ArcGIS 软件将龙胆潜在分布图层和海拔，年均降水量叠加，得出最优产区。龙胆最优产区主要分布在经度较高的辽东地区，主要包括抚顺市清原满族自治县南部地区；抚顺市新宾满族自治县南部地区；抚顺市抚顺县东南；本溪市本溪满族自治县中东部地区；本溪市桓仁满族自治县的中西部地区；丹东市宽甸满族自治县北部地区。除以上6 个分布较为集中的地区以外，还包括抚顺县、本溪市、岫岩满族自治县、凤城满族自治县、西丰县、盖州市、营口市、辽阳县、庄河市的小部分地区。

4 讨论

产地环境因素是决定药材是否适合引种栽培的决定性因素，也是影响药材有效成分含量的重要因素。龙胆在辽宁省的栽培历史悠久，是辽宁省的道地药材。但并非全辽宁省都适合种植引种，地区之间质量各异，因此研究环境因子、有效成分、样地三者之间的关系有利于龙胆在辽宁省的合理种植开发，节约资源。龙胆在辽宁省的分布主要集中在辽东，占90%以上，辽宁西部主要属于温带大陆性气候，气候干燥，辽宁东部主要属于温带季风性气候和少部分温带海洋性气候（大连市、丹东市），气候较湿润，因此气候是影响龙胆分布的重要因素。对龙胆分布影响最大的生态因子主要有11 月降水量、11 月温度、1 月温度、USDA、8 月降水量、最冷月最低温、土壤类型、海拔。辽宁省龙胆的花期在8—9 月份，8 月份降水量是影响龙胆开花的重要因素，最适范围在200～400 mm；10—11月为辽宁省龙胆的结果期，地上部分逐渐枯萎，11 月的温度和降水量共同影响龙胆的结果，这个时期温度的最适范围-10～5 ℃，降水量在30 mm 左右，干燥凉爽，最冷月最低温大约在-30～-10 ℃，气温寒冷有利于种质保存与来年的萌发，这也与龙胆喜凉耐寒的生长习性相吻合；粉沙壤土，土质较疏松保水保温，透气性好；黑土、石灰性黑土、铁质淋溶土、主要分布在辽东半岛及东北地区，土壤养分含量高。

RDA 可以对有效成分、环境因子、样地三者进行分析或两两分析。根据RDA 关系排序分析可知，对龙胆有效成分含量影响最具代表性的环境因子是经度，其次为坡度、年均温度、海拔、年均降水量、日照时数。龙胆的3 种环烯醚萜类成分龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及龙胆碱的含量都与经度呈正相关，经度越大成分含量也越大，日照时数和年均温是制约成分积累的关键因素。龙胆多糖相反，日照时数越长、年均温越高越有利于多糖的积累。ZF 衡量龙胆综合品质，与经度、坡度、海拔、年均降水量呈正相关，与日照时数和年均温呈负相关，与经度相关性最大。辽东山区海拔高，经度高，同时年均温低，降水量丰富，气候和环境因素有利于龙胆有效成分的积累，因此辽宁省龙胆的最优产区主要分布在辽东地区。

辽宁省龙胆的区划研究对于基于野生龙胆分布地区的栽培龙胆的开发有指导意义，避免了盲目引种造成的资源浪费，规划最优产区，引导农户合理选址种植。基于影响龙胆的分布适宜性的环境因子研究，利于根据相应环境因子开发适合龙胆种植的新区域；基于影响龙胆品质的环境因子的研究，利于提高基于某一单一成分生产需要的龙胆种植，提高龙胆的总体质量。