祝镔

（广西岑溪市三堡镇水产畜牧兽医站，广西 岑溪 543215）

黄颡鱼属于鲶形目鲿科黄颡鱼属，是我国重要的淡水经济鱼类，为广温性鱼，广泛分布于我国除西部高原外的国内各水域，因其皮光无鳞、肉质细嫩、鲜美回甘、肌间刺少、个体小、营养丰富等原因，受到消费者的喜爱。［1］黄颡鱼富含多种蛋白质和氨基酸，有助于人体锌、硒等微量元素的补充。［1，2］《医林集要》中记载，黄颡鱼具有益脾健胃、利尿消肿等功效，还具有抗衰老、促进儿童生长发育等作用。消费者的高度认可推动了黄颡鱼的人工养殖，先后涌现“黄优1号”［3］、“全雄1号”［4］等国家级新品种，2020年全国黄颡鱼养殖总产量达56.5万吨，实现每667 m2产量近5000 kg，在我国特色淡水鱼类养殖产量中排名第一，并逐渐成为我国水产养殖的重要组成部分。［5］

然而随着养殖规模的扩大、养殖密度和集约化程度的提高，病害逐渐凸显，尤其细菌性疾病频繁暴发，给黄颡鱼养殖业造成较大的经济损失。先后出现红头病、裂头病、鱼体溃疡病、腹水病、出血性水肿以及多种寄生虫病。主要病原有迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）、鮰爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）、嗜水气假单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）［6］以及车轮虫、指环虫等。［7］

迟缓爱德华氏菌又叫迟钝爱德华氏菌，是肠杆菌科爱德华菌属的革兰氏阴性短杆菌，有鞭毛，无荚膜，不形成芽孢，广泛存在于溪水、湖泊等淡水和海洋等水环境中，能感染多种动物，包括鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及哺乳动物，该菌是爱德华氏菌属中唯一能感染人的致病菌，能引起人的肠胃炎、腹泻等。［8］学者们先后在斑马 鱼（Danio rerio）［9］、大 菱 鲆（Scophthalmus maximus）［10］、日 本 鳗 鲡（Anguilla janponica）［11］、罗非鱼（Oreochromis mossambicus（Peters,1852）［12］、牙 鲆（Paralichthys olivaceus）［13］、鳜 鱼（Siniperca chuatsi）［14］、黄鳝（Monopterus albus）［15］等20多种鱼类中发现了该菌感染的病例。

本研究从广西多个养殖场死亡的黄颡鱼中先后分离到3株致病菌，分别命名为GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。通过形态学、生理生化特性、16S rDNA鉴定分析等方法，确定分离菌株为迟缓爱德华氏菌，进而通过药物敏感试验，成功筛选出具有较好疗效的药物，为黄颡鱼迟缓爱德华氏菌的预防控制提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 发病情况

2020年6～8 月间，广西3个大型黄颡鱼养殖场先后出现大量黄颡鱼死亡的病例，病程持续9～15 d，共造成3000尾约170 kg黄颡鱼死亡，涉及水域29.5 hm2，其中2个养殖场伴随同池养殖鱼类（青鱼、鲢鱼、鳙鱼、斑点叉尾鮰）的零星死亡。

3个养殖场黄颡鱼发病的临床症状稍有不同，分别表现为：1#养殖场病死鱼体表黏液多、头部发红、肛门红肿、体表有少量红斑；2#养殖场病死鱼除未见头部发红外，其他症状与1#养殖场相似；3#养殖场病死鱼体表多处发红，鳍条边缘溃烂、黏液多。

上述养殖场养殖密度为3000～4500尾/667 m2。发病时，水质较差，水呈黄绿色或蓝绿色，透明度5～10 cm；水温29～31℃；pH为7.6～8.8，溶解氧为3.5～5 mg/L，氨氮浓度为0.1～0.25 mg/L，亚硝酸盐浓度为0.1～0.4 mg/L。

1.2 主要试剂

脑心浸液肉汤培养基（BHI）（购自杭州滨和微生物试剂有限公司），营养琼脂培养基（购自北京陆桥技术股份有限公司），5%山羊血琼脂培养基（在营养琼脂培养基基础上添加5%山羊血，由作者无菌配制），新型微生物微量生化鉴定管和药物敏感纸片（购自杭州滨和微生物试剂有限公司），Premix TaqMix（RR003Q）、DL2000〔购自宝生物工程（大连）有限公司〕。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离及形态学观察

无菌解剖濒死黄颡鱼，分别采集心、肝、肾等脏器病变组织划线接种于5%山羊血琼脂培养基，37 ℃培养20 h后，挑取形态特征一致的优势菌落，进行细菌纯化、革兰氏染色，于1000倍光学显微镜下观察细菌形态；并将纯化的菌株，接种于BHI培养基，37 ℃培养后，采用甘油保存法，分装样品，并冻存于-70 ℃冰箱。［16］

1.3.2 生理生化鉴定

按照常规方法进行糖、醇类等生化试验，即分别选取3株纯化培养的细菌划线培养，挑取单菌落接种于微量生化反应管中，37 ℃培养24 h后，根据各生化反应管的实验结果及《常见细菌系统鉴定手册》［17］对各菌株进行鉴定。

1.3.3 细菌16S rDNA扩增及序列分析

分别取上述纯培养细菌接种于BHI培养基中，37 ℃培养20 h后，按参考文献［18］扩增细菌16S rDNA。PCR反应体系为50μL：Premix Taq预混液为25μL，菌液5μL，上游引物、下游引物各1μL，ddH2O 18μL。引物序列分别为5 ’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5 ’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。［2］扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI上分别进行BLAST同源性比对，利用MEGA11.0软件进行多重序列比对分析，采用邻接法（Neighbor-joining Method）构建系统发育树。

1.3.4 药物敏感实验

根据Kirby-Bauer琼脂扩散法测定抑菌圈直径，即分别取100 μL新鲜培养的3种菌液，均匀涂布在5%山羊血平板上，无菌挑取各种药物敏感纸片，分别贴在5%山羊血平板上，37 ℃倒置培养24 h，观察并测定各种药物的抑菌圈直径，依据美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）判定分离菌株对药物的敏感性。［8-11］

2 结果

2.1 细菌形态学观察

分离菌形态特性如图1所示。本研究从濒死黄颡鱼内脏中分离到3株细菌，分别命名为GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。该菌在血平板上出现明显的α溶血，菌落呈圆形、灰白色、表面光滑、边缘整齐、中间略隆起。通过革兰氏染色及显微镜观察，显示该菌为革兰氏阴性短杆菌。

图1 分离菌形态特性

2.2 生理生化试验结果

菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3的生理生化鉴定结果见表1，麦芽糖、葡萄糖、H2S、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、七叶苷、硝酸盐还原、D-甘露糖和磷脂酶均为阳性，其他各项均为阴性。该结果与《常见细菌系统鉴定手册》以及文献中关于迟缓爱德华氏菌的生理生化试验结果完全一致，结合形态学观察结果，初步判断GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3疑似迟缓爱德华氏菌。

表1 菌株生理生化鉴定结果

2.3 细菌16S rDNA扩增及序列分析

PCR扩增菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3的16S rDNA基因片段，通过PCR产物电泳，获得大小约1300bp目的片段。测序后与NCBI中收录的多种细菌16S rDNA基因片段进行序列比对，并绘制系统进化树（图2），由此可见，分离菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3与迟缓爱德华氏菌KJ725360、HM222643、HQ852209位于同一分支，同源性为100%，3种菌株间同源性也为100%。因此可以判定菌株GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3均为迟缓爱德华氏菌，根据生化实验结果、16S rDNA基因测序结果，推测3株分离菌相似性较高，选取菌株GXLJ20-1进行药物敏感试验。

图2 16S rDNA系统进化树

2.4 药物敏感试验结果

选取临床常用的34种药物，对菌株GXLJ20-1进行药物敏感试验，结果见表2，菌株对恩诺沙星、红霉素、甲砜霉素、四环素、强力霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、氟甲喹、诺氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、氟苯尼考、哌拉西林、头孢哌酮、卡那霉素、恶喹酸共16种药物敏感；对9种药物中度敏感，对9种药物表现为耐药。因此，在生产中，可在16种敏感药物中，根据生产实际进行选择，用于该菌的预防和治疗。

表2 药物敏感试验结果

续表

3 讨论

通过细菌分离鉴定，从广西大型养殖场大量死亡的黄颡鱼体内分离到迟缓爱德华氏菌，确定迟缓爱德华氏菌是致黄颡鱼及同池养殖的青鱼、鲢鱼、罗非鱼等鱼类死亡的病原。为了更好地预防和治疗该病，通过药物敏感试验筛选出恩诺沙星等16种敏感药物，生产过程中可根据实际情况选用敏感药物对迟缓爱德华氏菌进行预防和治疗。

美国、韩国以及我国广东、湖南、江苏、山东、广西、湖北、四川、浙江等地先后报道黄颡鱼“红头病”或“裂头病”，该病的主要表现为病鱼头顶部充血、出血、发红，颅骨顶部皮肤溃烂，甚至露出颅骨，严重时头顶穿孔，颅骨裂开，甚至露出脑组织；此外鳃盖、上下颌可见细小的出血斑，鳍条出血、腹部可见细小的出血斑，肛门就生殖孔充血、出血、外突；病鱼腹部膨大，有大量淡黄色腹水，肠道充血、发炎，胃内充满气体和淡黄色水样液体，肝脏肿大、有出血点或出血斑，颜色灰白，肾脏肿大充血。［19-23］

迟缓爱德华氏菌或鮰爱德华氏菌均属爱德华氏菌属，但迟缓爱德华氏菌毒力更强，广泛感染淡水河海水养殖鱼类。鮰爱德华氏菌主要为害斑点叉尾鮰，病程较快，但目前也有鮰爱德华氏菌感染黄颡鱼病例的报道，因此进行细菌的分离鉴定及药物敏感试验，才能有针对性地做好防治。［16，24，25］此外，迟缓爱德华氏菌是爱德华氏菌属唯一能够感染人的病菌，是一种人鱼共患病原，能引发人的胃肠黏膜及其深层组织的出血性或坏死性炎症、关节炎，甚至脑膜炎和败血症等疾病，值得引起重视。［17，26］

鱼类迟缓爱德华氏菌于1962年在日本首次发现，每年3～10月是引起黄颡鱼发病的高发季节，发病适宜水温多为22～28 ℃。目前对该病需坚持“预防为主、防重于治”的原则，加强日常管理，做好预防工作。首先，放养鱼前做好消毒，改善池塘底质环境，并加强日常水质管理，定期调控水质，避免应激；其次，加强引种管理，从源头控制病原，并控制养殖密度，合理追求产量；再次，科学投喂优质饲料，定期添加多种维生素、抗菌药物，并在水温不稳时控制投喂量，提高鱼体自身抵抗力；最后，在发生病害时，使用六亚甲基胍、聚维酮碘或生石灰等消毒剂，杀灭病原体，同时通过药物敏感试验筛选有效药物，进行鱼体治疗。［6，27］