董燕婕 范丽霞 苑学霞 邵阳阳 王 磊 赵善仓

(山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/山东省食品质量与安全检测技术重点实验室, 山东 济南 250100)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是目前世界上分布最广泛、影响较大的真菌毒素之一。脱氧雪腐镰刀菌烯醇属B族单端孢霉烯族化合物，俗称呕吐毒素，主要由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)侵染小麦、大麦、玉米等粮食作物产生[1-2]。DON可引起头晕、呕吐、腹泻等症状，长期摄入会破坏免疫系统；DON还具有很强的细胞毒性，可抑制蛋白质的合成，造成DNA损伤[3-4]。DON经植物或微生物代谢转化后可形成隐蔽型毒素(mask mycotoxin)[1,5]，包括乙酰化衍生物,如3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3a-DON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15a-DON)等。在某些情况下，农产品或食品中隐蔽型毒素的含量可能超过原型的含量水平，而且一些隐蔽型毒素会在体内代谢过程中重新转化为DON，对人类和动物健康造成潜在风险。联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)/世界卫生组织(World Health Organization, WHO)食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO ExperTCommittee on Food Additives，JECFA)认为DON乙酰化衍生物的毒性与DON相当[6]。因此，JECFA将DON的每日耐受量(permissible tolerable daily intake, PMTDI)(1 μg·kg-1BW)更改为DON及其乙酰化衍生物的PMTDI(1 μg·kg-1BW)。 我国也规定食品及饲料中DON、3a-DON和15a-DON的总量不得超过1 mg·kg-1[7]。研究表明，DON与其衍生型3a-DON、15a-DON共存于小麦、大麦、玉米等粮食作物及其副产品中[8-10]。因此，3a-DON和15a-DON的毒性和污染程度均需要重视。

目前已有大量关于DON毒性及其作用机理的研究报道，但针对DON以及其乙酰化衍生物的联合毒性及其机理尚鲜见报道。不同毒素间的相互作用会直接影响其混合物对生物体毒性的强弱，从而产生不同的毒性作用反应。研究表明，Raw264.7细胞与机体免疫功能相关，是评价DON暴露毒性的较为敏感的细胞模型；同时，DON具有抑制蛋白质合成，调节细胞因子和趋化因子基因表达的能力[11]。因此，本研究以Raw264.7细胞为体外试验模型，探究DON、3a-DON、15a-DON的二元和三元混合对细胞存活率、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和凋亡率的影响，采用复合指数法(combination index, CI)探讨二元、三元的联合作用效应，以期为多种毒素混合污染的提供一定的借鉴与参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠巨噬细胞Raw264.7，购自中国科学院上海细胞研究所；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)高糖培养基、胎牛血清、胰酶、无酚红HBSS，购自美国Gibco公司；DON、3a-DON和15a-DON标准品(纯度≥98%)购自美国Sigma公司，CCK-8试剂盒、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-Dichlorofluorescent yellow diacetate,DCFH-DA)试剂盒、罗丹明123购自上海碧云天生物技术公司。

1.2 主要仪器与设备

CCL-170B-8 CO2培养箱，艺斯高(上海)贸易有限公司；Synergy HTX多功能微孔板酶标仪，美国BioTek公司；VD-650-U超净工作台，美国Airtech公司。

1.3 细胞培养与染毒

Raw264.7细胞培养于DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、1.0%青霉素-链霉素)中，于37℃、5% CO2培养箱中培育至对数生长期。用超纯水溶解DON、3a-DON和15a-DON制成母液，使用前再用DMEM培养基稀释至所需浓度的工作液。

1.4 细胞毒性测定方法

1.4.1 细胞存活率的测定 采用CCK-8法分别测定毒素单独或混合处理对Raw264.7细胞活性的影响[12]，调整对数期细胞密度为3×104个·mL-1，每孔接种200 μL于96孔板中孵育24 h后，弃去培养液，加入含不同浓度DON、3a-DON、15a-DON的培养液继续培养24 h，控制DON、3a-DON、15a-DON终浓度分别为0.090、0.180、0.375、0.750、1.500、3.000 μg·mL-1。 每孔中加入10 μL CCK-8试剂，继续在96孔板中孵育2 h，用酶标仪测定其在450 nm波长处的吸光度值。

根据细胞存活率试验结果确定单独染毒的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，再根据IC50筛选出合适的DON、3a-DON、15a-DON单独染毒及其联合染毒的浓度。

1.4.2 细胞活性氧含量的测定 用氧化敏感荧光探针DCFH-DA(Beyotime)测定ROS的产生[13]。调整对数期细胞密度为5×105个/孔，接种于6孔板中，随后用DON、3a-DON、15a-DON(0、0.18、1.50、3.00 μg·mL-1)单独和联合处理48 h。用无血清培养基冲洗细胞，在10 μmol·L-1DCFH-DA中37℃孵育30 min。然后收集细胞用酶标仪检测细胞内二氯荧光黄(disperse fluorescent yellow，DCF)的荧光值(激发波长488 nm，发射波长521 nm)。

1.4.3 细胞线粒体膜透性的测定 调整对数期细胞密度为1×104个/孔，接种于96孔板，用DMEM培养基培养24 h，弃去培养基，每孔加入5 μg·mL-1罗丹明123工作液，孵育30 min后，1 000 r·min-1离心10 min，用培养基洗一遍，1 000 r·min-1离心10 min后加入各浓度组的毒素作用24 h，测定荧光值，最后根据标准曲线计算加药组细胞内检测到的罗丹明123含量，判断细胞内线粒体通透性的变化[13]。

1.5 统计与分析

各种毒素的IC50值采用Graphpad Prism 6.01计算，DON、3a-DON和15a-DON间的相互作用类型采用Chou-Talaly数学模型分析获得。混合物的联合毒性类型由CompuSyn(Chou and Martin, 2005, Compusyn Inc, USA)[14]软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 DON、3a-DON和15a-DON单独和联合对Raw264.7细胞存活率的影响

图1 DON、3a-DON和15a-DON单独对Raw264.7存活率的影响Fig.1 Individual effect of DON, 3a-DON and 15a-DON on viability of Raw264.7 cell

在暴露24、48、72 h时，DON、3a-DON和15a-DON对Raw264.7细胞的毒性作用均呈现剂量依赖关系(图1)。暴露24 h后，DON组细胞存活率由100%下降至9.94%，3a-DON组存活率由100%下降至24.11%，15a-DON组由100%下降到10.97%。根据浓度抑制率曲线可得DON、3a-DON、15a-DON作用细胞24、48、72 h后的IC50值(表1)。DON、3a-DON、15a-DON分别作用Raw264.7细胞24 h时，IC50依次为15a-DON(0.267 μg·mL-1)>DON(0.275 μg·mL-1)>3a-DON(1.806 μg·mL-1)；作用48和72 h时，不同毒素毒性作用差异与24 h类似，且IC50值随着培育时间的延长而降低，呈现时间依赖效应。因此，对Raw264.7细胞的毒性效应大小依次为15a-DON≈DON>3a-DON。基于CI指数法，CI>1表示拮抗作用；CI=1表示加和作用；CI<1表示协同作用。由此判断，DON、3a-DON、15a-DON二元或三元联合后的毒性效应发现，二元或三元联合后对Raw264.7细胞存活率的影响均高于单一毒素(表2)，相比于单一毒素组IC50的毒素剂量，二元或三元联合作用在本试验浓度设置叠加范围内，表现出一定的协同作用。

表1 DON、3a-DON和15a-DON对 Raw264.7的IC50值Table 1 Individual IC determinations of DON, 3a-DON and 15a-DON in Raw264.7 /(μg·mL-1)

表2 DON、3a-DON和15a-DON二元、三元混合对 Raw264.7的IC50和CI值Table 2 Binary and ternary combined IC50 determinations and CI values of DON, 3a-DON and 15a-DON in Raw264.7

2.2 DON、3a-DON和15a-DON单独和联合对Raw264.7细胞活性氧的影响

由图2可知，ROS浓度均随着其毒素浓度的增加而增加，存在剂量依赖性。除0.18 μg·mL-1低浓度组外，各毒素刺激作用组的ROS浓度显著高于对照组(P<0.05)。DON和15a-DON单独作用对细胞ROS浓度的影响差异不显著，但显著高于3a-DON处理组(P<0.05)。DON、3a-DON和15a-DON诱导细胞产生ROS的趋势基本一致。DON、3a-DON和15a-DON二元或三元联合的ROS浓度均分别大于相应的单独作用组，说明多毒素同时存在时毒性作用增强。

注：不同小写字母表示同处理组不同浓度间在0.05水平差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters aTThe top of the same treatment in differenTConcentration of mycotoxin indicated significant difference at 0.05 level . The same as following.图2 DON、3a-DON和15a-DON单独(A)和联合(B)对Raw264.7活性氧的影响Fig.2 Individual (A) and combined (B) effects of DON, 3a-DON and 15a-DON on ROS content of Raw264.7 cell

2.3 DON、3a-DON和15a-DON单独和联合对Raw264.7细胞线粒体膜透性的影响

图3反映了不同浓度的DON、3a-DON和15a-DON单独以及联合处理Raw264.7细胞24 h后线粒体膜透性的变化。与对照组相比，毒素处理组细胞线粒体膜透性增加，且随着毒素浓度的增加而不断增加，呈现出剂量依赖性(图3-A)。引发细胞内线粒体膜通透性转化的趋势为15a-DON>DON>3a-DON。DON、3a-DON和15a-DON二元、三元联合作用Raw264.7细胞24 h后(图3-B)，细胞内线粒体膜透性转化组间差异不显著(P>0.05)，但都大于相对应的单独染毒组。

图3 真菌毒素DON DON、3a-DON和15a-DON对Raw264.7细胞线粒体膜通透性的影响Fig.3 Individual (A) and combined (B) effects of DON, 3a-DON and 15a-DON on Raw264.7 cell

3 讨论

本研究探究了DON、3a-DON、15a-DON三种毒素单独和联合对Raw264.7细胞的毒性作用。结果表明，DON、3a-DON、15a-DON单独或联合作用均呈剂量、时间依赖关系，除低浓度外，均显著降低了细胞活性。采用IC50值比较这3种毒素的毒性强弱，表现为15a-DON≈DON>3a-DON。DON、15a-DON和3a-DON对不同细胞模型的作用均呈现出剂量和时间关系，但IC50值略有不同。Juan-Garcia等[15]研究发现3a-DON和15a-DON作用于人肝癌细胞系HepG2时，毒性效应为15a-DON>3a-DON。Pinton等[16]研究发现DON及其乙酰化衍生物对猪肠上皮细胞的毒性大小为15a-DON>DON>3a-DON。Yang等[17]评估了脱氧雪腐镰刀菌醇家族真菌毒素DON、3a-DON、15a-DON对人胃上皮细胞GES-1细胞存活率的影响，结果表明单一毒素对细胞的毒性作用为3a-DON<15a-DON

本研究发现，DON、15a-DON和3a-DON二元或三元联合后在设置的浓度范围内均呈现一定的协同作用。而Yang等[18]研究表明，DON+15a-DON仅在低和/或中度抑制浓度水平(IC10-IC70，IC10-IC80和IC10-IC40)对GES-1细胞表现为协同细胞毒性，在高浓度下呈现拮抗作用；Alassane-Kpembi等[19]研究表明，DON+15a-DON和15a-DON+3a-DON共同处理IPEC-1细胞时呈协同效应，DON+3a-DON在高浓度时呈协同效应。这可能是由于不同物种的细胞对不同毒素的代谢和受体/通路存在差异。

当细胞内ROS浓度超过其抗氧化能力时，易产生氧化应激反应[20]。DON、15a-DON和3a-DON单一或组合作用后均提高了细胞活性氧浓度和细胞线粒体膜通透性[21]，这与本研究结果相似。研究表明，在多种体外模型试验中氧化应激在DON诱导的毒性中起主要作用[22-25]。这可能是由于毒素刺激引发ROS的大量产生，细胞发生氧化损伤，从而导致细胞凋亡，线粒体膜完整性被损坏，使得线粒体膜通透性增加[26]。该结果再一次印证了DON诱导的毒性作用可能是由ROS和线粒体应激反应信号共同作用、相互影响的结果[27-28]。

4 结论

本研究表明，DON及其乙酰化衍生物均降低了Raw264.7细胞的活性，提高了细胞内活性氧的含量和细胞膜的通透性，且DON和15a-DON的毒性相当，均高于3a-DON。DON及其衍生物二元、三元联合后呈协同作用，毒性显著增强，因此在评价DON与其乙酰化衍生物混合污染的风险时需考虑其协同效应。但是目前DON及其乙酰化衍生物联合作用的毒性机制尚不清楚，仍需进一步探究其作用靶点和信号通路，为评估DON及其乙酰化衍生物的多残留联合毒性机制和制定限量标准提供科学依据。