尹玉婷，黄炜

上海市中医药大学附属龙华医院药学部，上海 200032

肝癌具有易转移、侵袭及预后不良等特点［1］，5年生存率仅为16.8%［2］。肝癌以手术治疗为主，放疗等为辅，但肝癌细胞敏感性低限制了放疗在临床的应用［3-4］。近年来，中医药在癌症治疗上已经取得了明显的效果。白头翁含有多种化学成分（三萜皂苷类、三萜酸和糖蛋白等），具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等药理活性，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡和自噬等过程［5-6］。白头翁皂苷A（PSA）是白头翁皂苷类分离提取的单体成分之一［7］，可抑制乳腺癌细胞的增殖，增加其放疗敏感性［8］。SIRT1在肝癌细胞中表达上调，miR-29c通过调控SIRT1表达调节肝癌细胞的增殖、凋亡和化学耐药性［9］。PSA在肝癌细胞中的增殖、转移和放疗敏感性的作用机制尚不明确。因此，2018年6月—2019年8月，本研究通过体外培养肝癌细胞（HepG2细胞），探讨PSA对HepG2细胞增殖、迁移、侵袭和放疗敏感性的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 HepG2细胞购自上海生命科学院细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000试剂盒、TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司；PSA购自上海翰香生物科技有限公司；si-NC、si-SIRT1、pcDNA、SIRT1序列和引物由上海吉玛制药技术有限公司合成；MTT试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；Transwell、Matrigel胶购于美国Corning公司；反转录试剂盒、AceQ qPCR SYBR®Green Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司；SIRT1抗体购自美国Abcam公司。Synergy HT型酶标仪购自美国Bio Tek公司；BDS200型倒置相差显微镜购自重庆奥特光学仪器有限公司；Applied Biosystems PCR热循环仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 细胞培养及分组 将细胞置于含胎牛血清的RPMI-1640培养基内培养，然后置于恒温培养箱，条件设置为37℃、5%CO2。收集对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×106/mL，接种到96孔板，分别用不同浓度（0、10、15、20 mg/L）PSA干预24 h，根据实验结果，分别将0、20 mg/L PSA干预的细胞记为对照组、PSA组。

1.3 细胞增殖能力检测 采用MTT法。取以上两组细胞，调整细胞密度为3×104/mL，接种到96孔板中，并在每孔加入5 g/L MTT溶液，在恒温培养箱内继续培养4 h，加入DMSO溶液150μL，用酶标仪检测每孔490 nm波长处的OD值。细胞活力（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 细胞迁移、侵袭能力检测 采用Transwell实验。细胞迁移能力检测：取以上两组细胞，离心后通过无血清的RPMI-1640培养基，调整细胞悬液密度至2×105/mL。在Transwell上室加入细胞悬液200μL，下室加入含血清的RPMI-1640培养基500μL。在恒温培养箱培养24 h，用甲醇固定，结晶紫染色30 min后，随机选取3个视野，100倍显微镜下观察细胞迁移数目，计数取平均值。细胞侵袭能力检测：将无血清的RPMI-1640培养基、Matrigel胶按照5∶1混合稀释，调整细胞悬液，其余步骤同迁移能力检测。

1.5 细胞放疗敏感性检测 采用克隆形成实验、单击多靶模型。取以上两组细胞，接种至6孔板内，然后分别给予0、2、4、6、8 Gy X射线照射24 h，在恒温培养箱内继续培养10～14 d。去培养基，PBS清洗2次，甲醇固定15 min，结晶紫染色30 min。在显微镜下选取细胞≥50个集落数，计算细胞存活分数。采用单击多靶模型在Graph Pad Prism 7.0拟合细胞存活曲线，模拟单击多靶模型，并计算以下参数：平均致死剂量（D0）、准闭剂量（Dq）、2 Gy细胞存活分数（SF2）、外推值（lnN=Dq/D0）、参数值（k=1/D0）、放射增敏比（SER）。

1.6 细胞内SIRT1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。通过TRIzol试剂盒提取以上两组细胞的总RNA后，检测其细胞浓度和纯度，然后反转录合成cDNA，经AceQ qPCR SYBR®Green Mix试剂盒进行PCR扩增。反应体系20μL：cDNA 1μL，正、反向引物各0.5μL，2×SYBR Green 10μL，无菌蒸馏水8μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性20 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s共40个循环。以GAPDH为内参。用2-ΔΔCt法计算SIRT1 mRNA相对表达量。SIRT1正向引物5'-GTTGTGTGCCTTCGTTTTGGA-3'，反向引物5'-AGGCCGGTTTGGGCTTATACA-3'；GAPDH正向引物5'-AGCTACTGGCGTCTTCACC-3'，GAPDH反向引物5'-CCACGATGCCAAAGTTGTCA-3'。

1.7 细胞内SIRT蛋白表达检测 采用Western blotting法。取以上两组细胞加入裂解液后，提取各组细胞的总蛋白。按照蛋白上样量50μg在凝胶电泳处理，将蛋白转移至PVDF膜内。室温封闭培养1.5 h并加入5%脱脂奶粉，然后加入一抗SIRT，稀释比例为1∶800，PBS清洗3次，加入山羊抗鼠IgG二抗稀释1∶5 000，PBS继续清洗3次，暗室内加入化学发光液显影、定影。Quantity One软件分析灰度值，以CAPDH为内参。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。符合正态分布的计量资料用±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

随PSA浓度的增加，HepG2细胞活力、迁移细胞数目、侵袭细胞数目均逐渐降低（P均＜0.05），见表1。经0、2、4、6、8 Gy X射线照射后，对照组细胞存活分数分别为100%、61.0%、35.4%、16.2%、6.0%，PSA组细胞存活分数分别为100%、28.1%、7.5%、1.4%、0.5%。与对照组比较，PSA组细胞存活分数低（P均＜0.05）。单击多靶模型参数见表2。与对照组比较，PSA组SIRT1 mRNA、蛋白表达低（P均＜0.05），见表3。

表1 不同浓度PSA对Hep G2细胞增殖、迁移、侵袭的影响（±s）

表1 不同浓度PSA对Hep G2细胞增殖、迁移、侵袭的影响（±s）

注：与0 mg/L比较，*P＜0.05。

?

表2 对照组与PSA组单击多靶模型参数

表3 对照组与PSA组SIRT1表达比较（±s）

表3 对照组与PSA组SIRT1表达比较（±s）

?

3 讨论

肝癌是全球癌症死亡较高癌症之一，每年死亡患者高达70万例［10］，其发病受多种因素的影响，如家族遗传、肥胖、环境和病毒感染等［11-12］。近年来，由于国民生活质量逐步提高，肝癌患者发病呈现年轻化趋势，严重威胁人类的生命健康安全。肝癌起病隐匿，在肝癌早期临床症状不甚明显，多数肝癌患者发现时已经处理中晚期，这是肝癌患者治疗面临的一大难题。随着医疗水平的进步，放疗是临床治疗肝癌的主要手段，但仍存在5年生存率低、复发和产生放疗耐药性等问题［13］。

白头翁属于毛莨科植物白头翁的干燥根，具有清热解毒、凉血止痢的功效，可用于治疗痢疾、湿疹和血痣等［14］。白头翁具有丰富的化学成分，其中有效成分皂苷对肿瘤的治疗效果明显。任楠楠等［15］研究结果显示，白头翁皂苷B4处理宫颈癌细胞，可通过激活Notch信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖和自噬。不同浓度白头翁皂苷可过抑制MAPK信号通路抑制肺癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡［16］。有研究结果显示，白头翁皂苷B4可抑制肝癌细胞增殖，使细胞周期阻滞，并诱导细胞凋亡［17］。彭超军［18］研究结果显示，PSA可以明显抑制非小细肺癌细胞的增殖，增加放疗敏感性，并诱导其细胞凋亡。以上均说明白头翁皂苷的抗肿瘤效果良好，对肝癌细胞具有增殖抑制和凋亡促进的作用，但是其对肝癌细胞迁移、侵袭和放疗敏感性的机制研究相对较少。鉴于此，本研究采用不同浓度PSA处理HepG2细胞，通过MTT、Transwell实验检测PSA对HepG2细胞增殖、迁移、侵袭的影响，结果显示HepG2细胞活力、迁移细胞数、侵袭细胞数呈剂量效应关系降低，提示PSA可抑制明显抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

电离照射细胞后，一些细胞会延迟死亡，这种细胞死亡程度与照射剂量有关，常用存活细胞分数表示，因此使用单击多靶模型对存活细胞分数与照射剂量进行拟合，计算得出相关参数值。使用多靶单击模型计算多个参数，其中D0反映每个细胞平均被击中所需的辐射剂量，Dq反映修复亚致死细胞损伤能力的大小，SF2反映敏感程度，lnN反映细胞内放射敏感区域，k是与射线的质及细胞敏感性有关的常数，SER反映细胞敏感度变化，SER越大反映辐射敏感程度越大［19］。本研究使用20 mg/L的PSA处理HepG2细胞，结果显示，PSA组细胞存活分数明显降低高于对照组，提示PSA对肝癌细胞的放疗敏感性增加，这与相关研究［18］结果相似。

Sirtuins蛋白家族具有多种催化功能，在调节葡萄糖和脂质代谢中具有重要作用。SIRT1是Sirtuins蛋白家族其主要成员之一，可介导参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和放射治疗等生物学过程［20-21］。SIRT1在肝癌细胞中高表达，杜仲醇可以下调SIRT1抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导其细胞凋亡［22］。下调SIRT1表达可促进肝癌细胞增殖、迁移，诱导其凋亡［23］。有研究发现，miR-204-5p通过下调SIRT1表达促进肝癌细胞增殖和药物敏感性，并 诱 导 细 胞凋 亡［24］。miR-150-5p通 过抑 制SIRT1表达诱导肝癌细胞凋亡，增加肝癌细胞的放疗敏感性［25］。以上说明SIRT1与肝癌发展密切相关，可以作为肝癌治疗和诊断的作用靶点。本研究结果显示，PSA处理HepG2细胞后，细胞中SIRT1 mRNA、蛋白表达下调，提示PSA可调控SIRT1表达。PSA可通过调控SIRT1的表达影响肝癌的恶性进展。

综上所述，PSA可以明显抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，增加其放疗敏感性，其作用机制可能与SIRT1有关，这为PSA对肝癌细胞的研究提供新的实验研究基础。本研究也存在不足之处，关于PSA对肝癌细胞的具体作用机制，及其可能相关的信号通路，需进一步探索。