郑新勇，闫福海

（1.天津瑞普生物技术股份有限公司空港经济区分公司，天津 300308；2.山东省鲁茂生态科技有限公司，山东 济南 250000）

犬瘟热是一种由犬瘟热病毒引起的传染病，病死率可达80%[1]。犬瘟热的初始临床症状为体温达39～41 ℃，精神萎靡，产生皱鼻喷气的反射动作[2]；约2 w内再次出现稽留热，产生脓性鼻液、脓性眼屎分泌物[3]，同时继发胃肠道痉挛等胃肠疾病，如呕吐、稀便等[4]；犬瘟热发病后期表现为典型的神经系统症状，流涎、肌肉抽搐震颤，此时难以治愈[5]。免疫犬瘟热疫苗是预防犬瘟热疾病的最有效方法。目前，疫苗生产主要采用传统的转瓶培养方法，即采用犬瘟热病毒接种已形成的单层细胞，培养后一次性收获病毒液[6]。但每个转瓶是单独的细胞培养单元[7]，单瓶细胞的产出量、病毒产出量和病毒效价均不同，导致疫苗生产批次间差异性大；且传统工艺操作性差、生产产能低[8]。应用细胞型生物反应器进行细胞的高密度微载体悬浮培养以制备疫苗尚未见报道[9]。微载体Cytodex 以葡聚糖为原料制备，适合细胞生长[10]。1967 年，有研究利用DEAE 葡聚糖凝胶A-50 研发得到世界上第一款微载体[11]，首次提出“微载体”的技术概念，将悬浮培养技术和贴壁培养技术有机结合，成功创建微载体悬浮培养工艺技术，为细胞的产业化奠定了基础，使其进入飞速发展的高密度阶段[12]。

为克服犬瘟热疫苗现有生产工艺的缺陷，本研究采用生物反应器生产犬瘟热疫苗，分别采用微载体选择、细胞培养周期、接毒收获周期等技术工艺，为产业化反应器悬浮培养代替细胞工厂的技术路线的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

犬瘟热病毒（CDV 株，105.0TCID50/0.1 mL），由中国农业大学动物医学院实验室鉴定保存；Vero 细胞（CCL-81，上海晶抗生物有限公司）。

1.2 试剂与设备

主要试剂及培养基：DMEM（批号：1693945，健顺生物科技有限公司）、二氯二甲基硅烷（硅油：F1721024，Sigma公司）、新生牛血清（Thermo Fisher Scientific Gibco）。

主要设备：7 L生物反应器（广州齐志生物工程股份有限公司）、Cytodex-1 型微载体（GE 公司）、高压灭菌柜（山东新华高压蒸汽灭菌设备）。

1.3 试验方法

1.3.1 生物反应器硅化

硅化剂倒入微载体瓶内，以瓶壁全部浸过为宜，转2～6圈，倒出回收硅化剂可重复使用。80 ℃干烤1 h，去除硅化剂的毒性。注意不可加入清洁剂清洗，应以注射水、采用柔软的纱布刷清洗；硅化剂为有毒物质，必须在通风橱里硅化。硅油涂布于生物反应器内表面，自然晾干12 h，加入无水乙醇后纯化水洗涤8～10次。

1.3.2 Cytodex-1载体处理

取已硅化的10 L 玻璃血清瓶，称取适量微载体加入50 mL无钙镁金属离子配制的PBS溶液，4 ℃浸泡过夜；转天弃PBS和残碎的微载体，加入PBS浸泡，沉淀后弃上清，反复2次此操作，120 ℃高压灭菌30 min，冷却至室温。

1.3.3 反应器准备

微载体121 ℃蒸汽灭菌30 min。自然冷却静置，弃PBS 缓冲液，以含10%NBS 的DMEM 培养液清洗2～3 次，注入反应器。

1.3.4 微载体培养Vero细胞

利用方瓶、转瓶等细胞培养器皿扩大培养Vero 细胞，经0.25%浓度胰蛋白酶消化，按每个微载体15～20 个细胞接种至微载体悬液，补加10%NBS 的DMEM 培养液至最培养终体积的一半后进行培养。生物反应器的参数设置为：温度37 ℃、pH值7.2、溶解氧30%～60%，转速30 r/min。

1.3.5 Vero细胞微载体悬浮培养最佳培养时间确定

细胞培养过程监控和处理：从培养的3 h 起，每6 h 取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，根据培养液葡萄糖的含量换加10%NBS 的DMEM 培养液，保证生物反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1 g/L。培养时间按照接种细胞后6、12、18、24、30、36 h取样时间确定细胞生长数量及生长状态，确定最佳的细胞培养时间。

1.3.6 CDV Vero细胞微载体悬浮培养收毒时间确定

以前期Vero 细胞微载体悬浮培养确定的最佳培养时间，进行DMEM 培养基悬浮培养Vero 细胞。得到的微载体培养Vero细胞静置5～10 min，待微载体沉至反应器底部时，弃去上清，按MOI为0.1接种犬瘟热病毒液。

生物反应器参数设置：温度35 ℃、pH 值7.3、溶解氧30%～60%，转速30 r/min。所述维持液为含体积百分含量2%NBS 的DMEM 培养液。接毒后按照6、12、18、24、30、36 h 取样观察细胞病变，确定最佳收毒时间，按照取样时间检测样品TCID50。

2 结果与分析

2.1 Vero 细胞微载体悬浮培养最佳培养时间确定（见表1、图1）

表1 Vero细胞微载体悬浮培养最佳培养时间确定Tab.1 Determination of optimal culture time for Vero cell suspension culture

图1 Vero细胞微载体悬浮培养生长状况Fig.1 Growth of Vero cells in microcarrier suspension culture

由表1 可知，按照生物反应器底料培养基葡萄糖浓度不低于1g/L进行补料原则，按每个微载体15～20个细胞接种至微载体悬液，最佳培养时间为30 h，培养Vero 细胞数量可达峰值8.20×106CFU/mL。

由图1 可知，36 h 时细胞开始凋亡。因此，最佳Vero细胞培养时间为30 h。

2.2 CDV Vero 细胞微载体悬浮培养收毒时间确定（见表2、图2）

由表2可知，按照MOI 0.1病毒感染复数接毒，接毒后收获的犬瘟热病毒效价108.50TCID50/0.1 mL，此时对应接毒时间为30 h。

由图2可知，细胞接毒30 h后，细胞基本病变数量大于50%。因此，最佳收毒时间为收毒后30 h。

3 讨论

CDV在世界范围内呈大流行性[13]。随着CDV毒株基因不断突变，宿主范围已由犬和猫扩大至其他哺乳动物，尤其是世界级濒危物种大熊猫[14]。中国农业科学院特产研究所先后研制了第一代水貂犬瘟热鸡胚成纤维细胞疫苗和第二代水貂犬瘟热活疫苗（传代细胞源），为有效控制我国毛皮动物犬瘟热疫情奠定基础。但随着生物制品生产规模不断扩大、工艺水平不断提升、生物制品市场需求量急剧增大[15]，传统转瓶工艺已无法满足现代疫苗企业的生产需求[16]。此时，逐渐进入研究人员的视线[17]。近年来，细胞微载体悬浮培养技术发展迅速，已经成为动物培养领域中较为先进的技术之一[18]，尤其是Vero细胞的悬浮培养技术，已被批准应用于人用生物制品的制备[19]。悬浮培养技术是指利用生物反应器对动物细胞实现产业化规模培养的技术，进而得到更高的产能及高品质质量[14]。微载体悬浮培养技术设备占地面积小、生产规模大、培养速度快、生产效率高、生产易于控制、不易污染、生产病毒滴度效价高、疫苗质量稳定[20]。整个培养过程有效实现了精细化控制参数，更精准直观地控制细胞的生长状况，进而得到更优质的生物制品产品。本试验结果表明，利用生物反应器培养犬瘟热病毒，主要采用培养参数工艺为：Cytodex-1型微载体按照10 g/L添加，每个微载体15～20个细胞接种至微载体悬液；生物反应器的培养参数为：温度37 ℃、pH 值7.2、溶解氧30%～60%，转速30 r/min。培养时间按照接种细胞后3、6、12、18、24、30、36 h 取样时间确定细胞生长数量及生长状态，确定最佳的细胞培养时间为30 h，此时细胞活力最好；接毒后，按照8、12、18h、21、24、30 h取样观察细胞病变，确定最佳收毒时间为30 h，此时的细胞感染后TCID50最高。本工艺研究为规模化生产工艺可行性奠定基础。

4 结论

本试验结果表明，CDV3-CL 株在Vero 细胞上进行微载体悬浮培养，最佳培养时间为30 h，细胞数量达8.20×106CFU/mL 即可接种病毒；接种病毒后30 h，细胞病变数量大于50%，效价TCID50可达10-8.5/0.1 mL。本试验论证了CDV 产业化反应器悬浮培养可实现产业化生产，有望推广并取代目前犬瘟热病毒抗原生产转瓶工艺。