甘勇辉，李 珍，林美珍*

(1 漳州职业技术学院 食品工程学院，福建漳州 363000；2 漳州卫生职业学院 药学系，福建漳州 363000)

兰科(Orchidaceae)植物是被子植物中的第二大类群，约有800属 25 000多种[1-2]。兰科植物广泛分布于热带、亚热带和温带地区，具有丰富的多样性[3-4]。在植物系统发育中，兰科植物的进化程度较高，尤其是花的形态和结构比较复杂[5-6]。兰科植物的有性生殖很特殊，其雌雄配子体、胚柄和胚型呈现多样性[7],但是，他们都有一个共同特征，即每朵花只有1个花药，其中的花粉聚集成块发育，这与其他被子植物的分散花粉有很大不同。虽然许多学者特别是国外学者对兰科植物的花粉块有较多研究，但对花粉块的发育特征很少报道。

石斛是中国《神农本草经》文献中最早记载的药用兰科植物之一，长期以来一直被列为中药上品。野生石斛对于生长环境要求严格，适合在高温高湿的热带雨林环境中生长、繁殖。铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)植物，为传统名贵的中药材，具有益胃生津，滋阴清热，润肺止咳，增强免疫活性的作用。现代医学研究证实其主要成分石斛多糖及石斛碱具有增强免疫力、促消化、抗衰老、保肝利胆、抗风湿、降血糖血脂、抗肿瘤等功效[8]。由于铁皮石斛的药用功能显著，经济价值较高，社会需求量逐年增加。在自然条件下，野生铁皮石斛种子发芽率不超过5%[9]，主要以侧芽的方式进行繁殖，繁殖系数低。另外，人们对野生铁皮石斛掠夺性采挖，使其野生资源日益减少，早在20世纪80年代，铁皮石斛就被国家列为重点保护的珍稀濒危药用植物[10]。目前国内铁皮石斛的繁殖多数采用组培苗方法，外植体来源复杂，种源纯度差，这造成了铁皮石斛种质严重退化。生产中迫切需要培育优良的铁皮石斛品种，然而铁皮石斛的有性繁殖研究很少报道。本试验对铁皮石斛雄性器官—花药的结构进行研究，探索其花药的发育过程。

1 材料和方法

野生铁皮石斛在中国南方花期为12月至次年春季3～4月，在花期根据花蕾的大小取不同时期的花药固定。花药先在3%(v/v)戊二醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液配制，pH 7.0)固定3 h，然后用相同缓冲液换洗3次，每次20 min。再用1%(v/v)锇酸(0.1 mol/L磷酸缓冲液配制，pH 7.0)在室温下固定4 h，或在4 ℃固定12 h。固定后的花药经过3次换洗，每次20 min，用10%～90%丙酮逐级脱水、置换、包埋在Embed 812树脂。包埋的花药被切成1 μm厚的半薄切片贴在载玻片上。切片采用高碘酸-席夫(Petiodic acid-shiff，PAS)反应标记多糖物质，多糖和淀粉粒呈红色。多糖染色后的切片再用苏丹黑(Sudan Black B)复染，检测花药细胞中的中性脂类物质，中性脂类物质呈黑色；染色后的切片用Leica DMR显微镜观察、拍照，为了进一步确定减数分裂时期，用高倍镜观察染色体的变化，并追踪其分布特征。

取开花时的成熟花粉块进行离体培养实验。培养基为15%蔗糖溶液附加0.01%无水氯化钙、0.01%硼酸和0.01%磷酸二氢钾，pH 6.5，观察花粉管萌发情况。

2 观察结果

2.1 铁皮石斛花器官特征

铁皮石斛的茎为圆柱形，不分枝，具有明显的节。总状花序侧生或顶生在茎节上，具2～6朵花。开花前，花蕾的花萼合生成囊状的萼囊，外形呈辣椒状，绿色(图版Ⅰ，A)。开花后，花萼变为五裂叶，呈黄绿色，类似花冠，花形呈海星状(图版Ⅰ，B)。在萼片内为雄蕊着生的合蕊柱，其中分布一些平行排列紫色斑纹。在合蕊柱顶部两侧各具1个紫点，雄蕊由花药(箭头)和花丝组成(图版Ⅰ，C)，且具白色药帽。将白色药帽(花药壁)由基部剥离后其中的花粉块显露出(箭头)(图版Ⅰ，D)。用解剖针将花药壁剥离后，2个花粉块释放出(箭头)(图版Ⅰ，E)。在高倍镜下可看到由2长条形花粉块组成。在幼期花药的横切图像中，可看到纵向一半的花药由2个药室组成(图版Ⅰ，F)，但随着花药的发育，两药室之间的药隔组织(箭头)溶解，两个药室贯通，2个花粉块粘在一起。开花时铁皮石斛的药帽开裂，成熟花粉块常已弹出。因此，铁皮石斛的雄蕊具1个花药、4个药室和4个花粉块。

2.2 小孢子母细胞减数分裂特征

减数分裂是花粉由二倍体的孢子母细胞向单倍体雄配子体的转变过程。铁皮石斛花药中央的小孢子母细胞在没有特殊变化前兆就开始减数分裂过程，其他被子植物在减数分裂前，常在小孢子母细胞表面有1层厚厚的胼胝质壁。但是铁皮石斛小孢子母细胞在分裂时没有胼胝质壁合成，未见胼胝质壁结构，这时小孢子母细胞(MMC)中央出现颗粒状结构的染色体，确定其减数分裂时期(图版Ⅰ，G)。在绒毡层和小孢子母细胞之间也没有异常的细胞壁增厚现象，显示铁皮石斛小孢子母细胞壁的特殊性。减数分裂Ⅰ结束后，染色体移向细胞的两极，在小孢子母细胞内形成了二个细胞核，在二核之间没有细胞壁的形成(图版Ⅰ，H)。在减数分裂Ⅱ结束后，在四个细胞核之间形成细胞壁，构成不定型的四分体(图版Ⅰ，I)。由此可见，铁皮石斛小孢子发生为同时型。

在减数分裂时期，花药壁的细胞结构没有明显的差异，但四层药壁细胞已可明显区分：由外向内分别是1层表皮细胞、2层药室内壁细胞、1层中层细胞、1层绒毡层细胞(图版Ⅰ，J)。在4层药壁细胞中，表皮和药室内壁细胞已高度液泡化，细胞中的大液泡占据了大部分细胞空间，将细胞核挤到细胞周缘区域。这些细胞染色很浅。中层细胞此时的体积很小，没有明显的细胞结构特点。药壁最内层为绒毡层细胞，液泡化程度低，显示细胞质的染色较深。小孢子母细胞时期的绒毡层细胞中没有特殊的结构物质(图版Ⅰ，J)，但在减数分裂结束后的四分体时期，绒毡层细胞中出现许多体积较大的脂滴(图版Ⅰ，I)，显示此时绒毡层细胞中活跃的脂代谢。

2.3 花粉发育特征

铁皮石斛小孢子母细胞减数分裂后，形成的四个小孢子并不分开，而是以四分体(四合花粉)状态继续发育。与之前(图版Ⅰ，I)相比，四个小孢子之间的细胞壁明显增厚，但各个四分体的轮廓依然清晰。在花药壁中，4层细胞没有明显的变化，绒毡层细胞中仍有一些大的脂滴分布在其外切向面，而内切向面没有，呈现出极性分布(图版Ⅱ，A)。在小孢子时期，常可看到小孢子细胞核比较明显，位于细胞中央，但核的外形不规则，有表面突起。小孢子细胞核的不规则外形是否代表了小孢子生理代谢的特异结构需要深入研究。在铁皮石斛小孢子发育时期，一个显著结构变化是在花粉块表面开始形成了1层厚厚的花粉外壁结构，但在花粉块内部，四合花粉的表面上没有花粉外壁结构(图版Ⅱ，B)。根据本实验的染色结果，花粉块表面上的花粉外壁为脂质性质，与大多数植物的孢粉素花粉外壁性质相同。

随着小孢子的分裂，四合花粉块中的花粉进入二胞时期。小孢子分裂时染色体集中在细胞中央，并没有呈现出极性分布(图版Ⅱ，C)。然而在小孢子分裂完成后，二胞花粉则呈现出特异的分布：在四合花粉中，小的透镜状生殖细胞位于花粉的外侧，而内侧绝大部分空间为大的营养细胞(图版Ⅱ，D)。以后，二胞花粉中的生殖细胞一直保持在原位不变(图版Ⅱ，E、F)。接近开花时，花药壁的药室内壁细胞形成了纵向加厚的纤维壁。临近成熟花粉中，生殖细胞仍在四合花粉的外侧分布(图版Ⅱ，G)。与其他被子植物成熟花粉中积累大量淀粉或脂滴营养物质不同，铁皮石斛成熟花粉中既没有淀粉也没有脂滴营养储存物质，这是铁皮石斛花粉的一个特征。

虽然在药室中发育花粉的形态结构变化不显著，但药壁绒毡层细胞发生了显著的形态结构变化。在小孢子分裂前，绒毡层细胞中出现较多的大脂滴；小孢子分裂后，绒毡层细胞中的脂滴明显减少(图版Ⅱ，C、D)。随着花粉块发育，绒毡层细胞中的脂滴彻底消失，绒毡层细胞膨大，并在原位分解(图版Ⅱ，E)。但是随着绒毡层细胞的降解、退化，药壁的中层(ML)细胞没有退化，其细胞体积增大，细胞染色变深暗示其中的脂类物质增加(图版Ⅱ，F)。临近开花时的成熟花药中，药室内壁细胞(En)形成纤维状细胞壁，中层细胞也没有退化，依然保留着(图版Ⅱ，G)，这与其他植物不同。铁皮石斛花药壁细胞的结构变化特点是绒毡层细胞中途退化，但中层细胞没有退化，保留到花药成熟，其结构变化与花粉块外壁的形成有关。

2.4 花粉块中花粉的萌发

铁皮石斛花粉块表面有一层典型的花粉外壁结构，但在该外壁上没有萌发孔结构。另外在花粉块内部的四合花粉没有花粉外壁结构。因此，铁皮石斛花粉块中花粉的萌发是一个有趣的问题。为此，我们进行了花粉块离体培养实验，探索其花粉萌发过程。在含15%蔗糖、0.01%无水氯化钙、0.01%硼酸和0.01%磷酸二氢钾的培养基中培养10～15 h，花粉块长出了花粉管。显微观察显示花粉管由花粉表面形成，而在花粉块表面有花粉外壁的地方没有花粉管形成(图版Ⅱ，H)。在培养前的花粉块很结实，四合花粉不易分开，经过人工培养后，花粉块变得很松散，但仍保持四合花粉状态，萌发的花粉管由花粉的外侧部位形成。

3 讨 论

多数植物小孢子母细胞减数分裂后的四分体小孢子分开，随后单个花粉独自发育。有些植物的小孢子四分体不分散，4个小孢子结合成整体发育，即四合花粉。有些植物更多花粉聚集成花粉小块(massulae)；也有些植物的花粉小块再聚集成团发育，称为花粉块(pollinium)[11]。各种植物花粉聚集状态不同，花粉发育各有其特征，主要表现在花粉表面的壁结构差异。对分散的单花粉发育的结构特征已经做了详细研究，常常根据花粉发育结构特征分为7～8个发育时期：造孢细胞、小孢子母细胞、四分体、早期小孢子、晚期小孢子、早期二胞花粉、晚期二胞花粉或三胞花粉[11]。每个时期花粉中都经历了特殊的细胞结构变化，以适应花粉发育中的生理功能转变。经过一系列程序性的发育变化，花粉形成结构高度简单但生理代谢极其复杂的三细胞雄配子体，具备了受精的功能。然而，花粉块的发育过程研究较少，特别是兰科植物小孢子发生类型尚未见报道，本研究首次报道了兰科植物铁皮石斛的小孢子发生为同时型。

3.1 铁皮石斛花粉母细胞的胼胝质壁

在被子植物有性生殖中，胼胝质壁的形成是孢子母细胞减数分裂前的一个特征。胼胝质壁含有β-1,3-葡聚糖，易于合成和降解。胼胝质壁只发生在减数分裂前的孢子母细胞和减数分裂后的四分体孢子表面，起着临时分隔孢子母细胞和孢子的功能，防止这些细胞在减数分裂中发生细胞融合或遗传物质的不均等流动，确保后代的稳定性。孢子母细胞形成胼胝质壁也可能是启动减数分裂的先决条件[11]，并作为小孢子外壁形成的模版。然而最近在金线莲花粉块发育研究中，发现减数分裂前在整个花粉块的表面上形成了典型的胼胝质壁，但在花粉块内部的小孢子母细胞没有胼胝质壁[12]；本实验中铁皮石斛小孢子母细胞进入减数分裂时，花粉块表面及内部的小孢子母细胞也无胼胝质壁(图Ⅰ，G)。据此，胼胝质壁启动孢子母细胞减数分裂的功能和减数分裂的调控规律在具花粉块的植物中还需要进一步探索答案。

3.2 铁皮石斛花粉块的外壁

被子植物的花粉外壁是绒毡层分泌的脂类代谢物在花粉表面形成的特殊结构，具有保护花粉和帮助传粉的功能，其中包括花粉萌发时花粉管生长的萌发孔[13]。然而，在花粉块植物中，花粉外壁及萌发孔情况又是如何呢？Passarelli和Rolleri[14]对南美Habenaria属的4种小花粉块进行了研究，发现花粉壁结构因其在四分体中的位置不同而有差异：花粉块表面形成了完整的花粉外壁和具有小柱的内壁，而花粉块内部的花粉缺乏外壁或仅发育出高度简化的外壁。这些研究都注意到兰科植物花粉块中的花粉位置差异和壁层特征。本实验中，铁皮石斛花粉块表面也有1层显著的花粉外壁结构，但花粉块内部的四合花粉则无该结构，这与许多兰科植物的研究结果一致，显示出花粉块中花粉的位置差异。同时，本研究结果表明：第一，铁皮石斛在花粉块表面的花粉外壁上未观察到萌发孔的结构；第二，在花粉块离体萌发实验中，未观察到花粉块表面花粉萌发，只观察到内部花粉萌发的现象。有关花粉块的花粉萌发值得进一步探讨研究。