翟佳丽，坝玉蓉，甘 雪，徐慧妮

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，昆明 650224)

氮是植物生长和产量的一个重要因素，影响着植物的生物过程[1]。氮的缺乏导致许多植物的光合作用显著下降，影响植物细胞分裂和生长，从而导致植株矮小，分支分蘖减少，叶片发黄，叶片早衰，最终导致产量减少[2]。缺氮后恢复供氮，植物生长趋向正常，但表型性状、干物质质量和根系的恢复程度不同[3]。研究发现，玉米幼苗复氮后，根系活力有一定的恢复，但仍显著低于正常处理[3]。冬小麦研究表明，缺氮会导致植物体内谷氨酸浓度下降，恢复供氮后其浓度回升[4]。缺氮胁迫影响了植物的正常代谢活动，除与氮素相关的转运子及转录因子外，与植物代谢调节相关的基因也常在缺氮胁迫转录组中呈现明显的表达变化[5-6]。研究表明，AP2/ERF、WRKY、NAC 和 MYB 等与植物非生物逆境胁迫相关的转录因子也常在缺氮条件下表达量升高[7]。

MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子是指含有高度保守的DNA结合区-MYB结构域的一类转录因子，是植物中最大的转录因子家族之一[8-9]。MYB 转录因子在植物整个生长发育、次生产物代谢、生物和非生物胁迫应答等方面都起着至关重要的作用[10]。依据MYB基序重复种类和数目的不同，将整个MYB 转录因子家族分为四类：4R-MYB、3R-MYB、1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB[11]，且R2R3-MYB转录因子是植物中数目最多的一类，具有广泛的生物活性，参与植物体内的各种生理生化活动[12]。研究表明MYB通过直接靶向结合相关代谢酶基因的启动子调控其表达，从而实现对类黄酮[13]、木质素[14]、黄酮醇[15]、花青素和原花色素[16]、苯丙酸代谢[17]、纤维素[18]等次生产物代谢的调控。此外，MYB转录因子(尤其R2R3型MYB转录因子)通过直接或间接调控下游逆境相关基因的表达来增强或减弱植物对逆境的适应性。研究发现，拟南芥AtMYB20的过表达植株在盐胁迫下表现出更高的抗性[19]；大豆R2R3-MYB基因GmMYB68的转基因植株对盐碱胁迫的抗性增强[20]，其转录因子GmMYB101在氮代谢调节中起重要作用[21]；谷子MYB类转录因子SiMYB42基因可以调控下游硝酸盐转运基因的表达影响植物低氮胁迫耐性[22]。

番茄R2R3-MYB基因家族中有121个成员，在应答非生物胁迫和信号转导途径中发挥主要作用[23]。SlMYB49可以提高干旱和盐胁迫的抗性[24]，SlMYB102可以提高转基因番茄的盐胁迫抗性[8]，而番茄SlMYB86在缺氮胁迫下功能和作用机制还未见报道。本研究克隆了番茄转录因子SlMYB86基因，通过qRT-PCR分析缺氮胁迫下SlMYB86表达，并对其编码蛋白进行原核表达分析，用Western blot验证SlMYB86对缺氮胁迫的应答，为后续生物学功能和分子机制研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料及处理

实验材料为番茄(SolanumlycopersicumL.)品种‘黄果’自交系，于本实验室保存。挑选颗粒饱满的番茄种子，用50 ℃的无菌水浸泡30 min，将种子铺于湿润的滤纸上，于25 ℃恒温培养箱催芽48 h左右，待种子大部分露白后播种于蛭石中。待幼苗生长到一片真叶，将表型一致的幼苗移栽到盆中，当幼苗处于三叶期时开始缺氮处理。番茄幼苗于缺氮营养液中处理2 d，之后将番茄幼苗转移到含有10 mmol/L NO3-正常氮营养液中(CK，含有2.5 mmol/L硝酸钙和5 mmol/L硝酸钾)。实验共设置6个处理：(1)正常处理(CK)；(2)缺氮6 h(-N 6 h)；(3)缺氮24 h(-N 24 h)；(4)缺氮2 d(-N 2 d)；(5)缺氮复氮6 h(-N+N 6 h)；(6)缺氮复氮24 h(-N+N 24 h)，每个处理设置3个重复。将不同处理后番茄幼苗的根、叶立即在液氮中冷冻，并储存在-80 ℃。实验在昆明理工大学温室自然条件下进行，白天气温23～28 ℃，夜间13～18 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 番茄SlMYB86的生物信息学分析从Sol Genomics Network、Plant Transcription Factor Database、NCBI 网站下载R2R3-MYB类的番茄(SolanumlycopersicumL.)、拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)、黄瓜(CucumissativusL.)的蛋白质序列，使用 MEGA 7.0 软件对MYB蛋白构建系统进化树，Boot-strap设置1 000 次，使用Jalview 2.9.0.1软件对蛋白质序列进行比对与分析，使用TBtools 1.09852软件对SlMYB86转录因子的结构进行分析。

1.2.2 qRT-PCR分析使用Trizol试剂(TaKaRa)从番茄叶片及根部提取总RNA。利用Yeasen公司的Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)试剂盒将RNA反转录成cDNA,使用 Hifair®qPCR SYBR®Green Master Mix试剂盒进行mRNA表达水平分析。使用CFX96实时PCR机(Bio-Rad，美国)进行qRT-PCR，基因相对表达量计算用2-ΔΔCT法。

1.2.3SlMYB86原核表达载体构建通过Sol Genomics Network 查找SlMYB86的cDNA序列(Solyc02g082040.2.1)，SlMYB86的编码框大小为975 bp。根据基因序列设计带有pET-28a接头的特异性引物SlMYB86-EcoRⅠ-F(CGCGGATCCGAAT-TCATGGGTCATCACTGCTGC)和SlMYB86-HindⅢ-R(TGCGGCCGCAAGCTTACAATCCCATGCAAGT)，利用Trizol法提取番茄总 RNA，将RNA逆转录为cDNA，用cDNA作为模板，通过PCR扩增得到SlMYB86的编码区，通过同源重组的方法，将SlMYB86重组到pET-28a载体中，挑取阳性菌落，进行PCR及测序验证。

1.2.4 SlMYB86重组蛋白诱导表达使用DNAMAN软件分析，SlMYB86蛋白相对分子量大约为37.089 kD，pET-28a载体所带的His标签加上SlMYB86蛋白后，大小约为41 kD。将测序成功的SlMYB86原核表达载体转入E.coliBL21表达菌株，接种到含有卡那霉素(50 mg/L)的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min过夜活化。将活化菌液再以1∶100比例接种到20 mL LB培养基中，于37 ℃、200 r/min培养至OD600为0.5～0.8。加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG，分别于37 ℃、28 ℃条件下进行诱导，取0、2、4、6和8 h后的菌液各2 mL，12 000 r/min离心1 min，收集菌体，用1×TBS洗2次，最后菌体沉淀用100 μL的2×蛋白质电泳上样缓冲液重悬，沸水浴煮10 min，冷却后进行SDS-PAGE分析，选取最佳诱导条件。

1.2.5 SlMYB86蛋白纯化及抗体制备培养pET-28a-SlMYB86菌液，使其OD值在0.5～0.8，诱导蛋白质表达。将1 mL细菌培养物10 000 g离心2 min，弃上清液。将细胞沉淀于-70 ℃冷冻5 min，通过反复冻融使细菌菌株实现最大程度的裂解。使用Promega公司的MagneHisTMProtein Purifi cation System(V8550)进行蛋白纯化。将所纯化的蛋白1∶1加入2×蛋白质电泳上样缓冲液(含有β-巯基乙醇)，沸水浴10 min使蛋白变性，冷却后立即上样，通过SDS-PAGE分析样品。用纯化得到的融合蛋白为抗原，定期免疫昆明小鼠，通过眼球取血获得抗血清。

1.2.6 Western blot分析SDS-PAGE后，将蛋白胶于转膜缓冲液中浸泡平衡15 min，裁取8.5 cm × 5.0 cm的 PVDF膜，置于转膜缓冲液中平衡15 min。按照自上而下滤纸-凝胶-膜-滤纸的顺序平铺于转膜仪上，30V，200 mA，转膜 1.5 h。转膜结束后，用20 mL TBST洗10 min，随后将膜放置于封闭缓冲液(含 5% 脱脂牛奶的 TBST)中室温孵育封闭2 h。用20 mL TBST 洗3次，每次10 min。按1∶5 000 的比例加入一抗，4 ℃ 过夜孵育。用20 mL TBST洗3次后按1∶5 000的比例加入山羊抗小鼠二抗，室温孵育1 h后用 TBST洗 3 次，使用蛋白显影液检测。

2 结果与分析

2.1 番茄SlMYB86生物信息学分析

番茄SlMYB86和其他物种MYB转录因子聚类分析结果表明，番茄SlMYB86与番茄SlMYB26在进化树上属于同一分支，亲缘关系较近(图1，A)。番茄MYB保守域序列比对发现，番茄R2R3-MYB类转录因子含有2个MYB基序，R2保守域中有3个保守的色氨酸残基，R3保守域中第一个色氨酸残基被苯丙氨酸所替代且含有2个色氨酸残基(图1，B)。对SlMYB86转录因子的结构分析发现，目的基因N端含有2个Myb_DNA-binding保守结构域，与R2R3-MYB类转录因子特征一致，表明SlMYB86转录因子属于R2R3-MYB型转录因子(图1，C)。

2.2 缺氮胁迫下番茄幼苗SlMYB86基因的表达

图2结果表明，与对照组相比，随着缺氮时间的增加，番茄幼苗根与叶中SlMYB86的表达量逐渐增加，在缺氮2 d时，番茄幼苗根与叶中SlMYB86的表达量约为对照组的12.6和16.5倍。在缺氮处理后对番茄幼苗进行了复氮处理，复氮处理6 h时，番茄幼苗根与叶中SlMYB86的表达量开始下降，与缺氧 2 d相比分别下降了25.2%和38.9%。以上结果表明，与对照组相比，缺氮条件下番茄幼苗根与叶中SlMYB86的表达量显著增加，SlMYB86基因在缺氮条件下被强烈诱导，说明SlMYB86基因参与了缺氮胁迫应答。

2.3 pET-28a-SlMYB86原核表达载体构建

通过RT-PCR扩增SlMYB86基因编码框，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，扩增产物大小约为975 bp(图3，A)，与预期大小相符，且无杂带，特异性强，将目的片段回收纯化。通过同源重组的方法，将目的片段连接到EcoRⅠ和Hind Ⅲ 酶切回收后的原核表达载体pET-28a上，并转化E.coliDH5a，获得pET-28a-SlMYB86原核表达载体。挑取单菌落进行PCR验证，扩增产物大小约为975 bp(图3，B)，与预期大小相符。将阳性克隆测序，测序结果与序列一致，表明原核表达载体构建成功，命名为pET-28a-SlMYB86。

2.4 pET-28a-SlMYB86的诱导和表达

pET-28a-SlMYB86使用0.5 mmol/L的IPTG，分别于28和 37 ℃条件下进行诱导表达，进行SDS-PAGE检测。结果(图4)发现，SlMYB86蛋白在28 和37 ℃条件下，随着诱导时间增加蛋白表达量也增加，且37 ℃下蛋白表达量明显高于28 ℃。综上，SlMYB86重组蛋白在大肠杆菌E.coliBL21菌株中的最佳诱导条件为：IPTG浓度0.5 mmol/L，诱导温度为37 ℃，诱导时间为 8 h。

2.5 SlMYB86蛋白纯化及Western blot分析

在最佳诱导条件下对SlMYB86蛋白进行诱导纯化，并对上清液进行SDS-PAGE检测(图5，A)，在细胞裂解液、流穿液中没有得到纯化蛋白，在洗脱液中成功检测到目的条带，且条带单一，蛋白大小约为41 kD，与预期大小相符，表明在洗脱液中成功获得了SlMYB86蛋白。SDS-PAGE后，将蛋白转移到PVDF膜上，用His抗体进行Western blot检测，发现在约 41 kD 位置出现一条明显的蛋白纯化条带(图5，B)，表明获得了较高纯度的SlMYB86原核蛋白，纯化蛋白将用于后续实验。

2.6 缺氮及复氮条件下番茄幼苗SlMYB86蛋白的表达量

利用SlMYB86抗体进行Western blot分析发现，SlMYB86蛋白随着缺氮时间的延长表达量增加(图6，A)；在缺氮2 d时，与CK组相比SlMYB86蛋白表达量达到最大。与缺氮2 d相比，复氮6 和24 h条件下，SlMYB86蛋白表达量有所减少(图6，B)，Western blot检测结果与qRT-PCR检测结果规律保持一致。结果表明，SlMYB86参与了缺氮胁迫应答，且SlMYB86蛋白在缺氮胁迫后表达量显著增加。

3 讨 论

在拟南芥、烟草、小麦、荞麦、水稻和玉米等[25-28]植物中分离并克隆得到很多MYB 基因。1996年，Lin等[29]首次在番茄上克隆获得14个MYB相关基因片段。2003年，蔡新忠等[30]以烟草MYBl中MYB保守区域编码序列中的2个特异性序列为引物，在番茄中扩增两个长度为215 bp的MYB基因片段LeMYB1和LeMYB2，在植物过敏性反应和抗病性产生中起重要调节作用。2011年，张欣等[31]从番茄中分离得到一个MYB类新基因SlCMYB1，为典型的R2R3-MYB类转录因子，定位在细胞核中，在高温、干旱、盐和脱落酸胁迫的诱导下，该基因的表达量有明显的变化，将其转入水稻中可显著提高水稻对低温胁迫的耐受能力。说明MYB转录因子在抗逆过程中起到重要的调控作用。

原核表达系统是目前最为成熟的蛋白表达系统，其优点在于成本低廉，能够在较短的时间内获得目的基因高效表达蛋白。这项技术的主要方法是将目的基因 DNA 片段，与原核表达载体进行连接，构建重组表达载体，转化大肠杆菌，通过使用不同浓度的IPTG在不同时间及温度下诱导并纯化，获得所需的目的蛋白[32]。有研究表明，0.1～1 mmol/L的 IPTG有利于重组蛋白的诱导表达[33]，而低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤[34]。为深入研究番茄SlMYB86在番茄中生物学功能，本研究构建了SlMYB86基因原核表达载体pET-28a-SlMYB86，并成功在大肠杆菌E.coliBL21菌株中大量表达。通过融合蛋白携带的His标签进行纯化蛋白，免疫小白鼠制备了多克隆抗体。用Western blot证明成功获得了SlMYB86重组蛋白。为进一步研究SlMYB86基因的功能奠定了基础。

研究表明，MYB转录因子在应答缺氮胁迫中具有重要的作用。单细胞红藻 MYB 转录因子CmMYB1 可以调节植物的氮素利用[35]。海棠花MYB 转录因子MsMYB10通过改变花青苷等类黄酮化合物的积累量来应答低氮胁迫，最大程度保护机体不受损害[36]。MYB61受GRF4调控，促进水稻氮素利用和生物量生产[37]。OsMYB305过表达抑制了低氮条件下纤维素的生物合成，从而释放了碳水化合物用于硝酸盐的吸收和同化，促进了水稻的生长[38]。在MYB 4个亚家族中，主要是R2R3-MYB 亚族成员参与调控氮代谢吸收相关的基因的表达调控[39]。本实验中克隆的SlMYB86 转录因子也属于R2R3-MYB 亚家族，qRT-PCR和Western blot分析表明缺氮胁迫下SlMYB86表达显著增加，该基因参与了缺氮胁迫应答。这为今后进一步研究番茄MYB86在抗逆性中的功能研究提供基础。