张 淼， 史新月， 董 娜， 于志军， 刘敬泽

(河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024)

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容和前沿热点，在生物的生长发育及环境响应过程中发挥着重要作用.其主要通过DNA甲基转移酶，将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到特定碱基上实现化学修饰，发生位点包括腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等[1].该过程可导致基因沉默、组蛋白修饰和磷酸化，某些情况下还可能导致基因激活[2].越来越多的证据表明，DNA甲基化与许多生物过程密切相关[3-5].如在结直肠癌细胞中发现大量异常的甲基化基因，这些基因的非启动子区域甲基化水平总体较低，启动子区域甲基化程度明显较高[6].研究表明，若癌基因的甲基化水平降低或去甲基化可激活其基因表达或导致染色体空间的结构不稳定；若抑癌基因甲基化水平升高则使其表达下调或导致DNA损伤修复受抑制，进而对细胞周期或细胞凋亡等生物学过程产生明显影响[1].

DNA甲基化在转录调控、转座元件失活和基因组印记等过程中发挥重要作用[7-9]，其通过基因表达的转录后调控参与许多基本的生物过程，并可调控生物对非生物胁迫的响应[9].研究表明，DNA甲基化水平与热应激、冷应激和光照等环境因素密切相关[10-11]，不同个体的DNA甲基化差异可引起表型变异，进而适应不同的环境[12-16].

昆虫纲是节肢动物门乃至动物界最大的类群，其形态复杂，具有变态发育等特有生理过程.DNA甲基化可调节昆虫胚胎发育、参与基因印记、调控级型和翅型分化、影响性别决定和介入抗药性形成等[17]，如DNA甲基化在蜜蜂分化为工蜂和蜂王的过程中发挥重要调控作用，将刚孵化的蜜蜂幼虫DNA甲基转移酶3基因沉默后，幼虫可发育为蜂王[18-19].不同饲养方式导致的散居和群居型的飞蝗Locustamigratoria，DNA甲基转移酶 1(DNMT1)、DNA甲基转移酶2(DNMT2)和DNA甲基结合蛋白存在显著的表达差异[20].白背飞虱SogatellafurciferaDNA甲基化的含量影响翅发育，短翅型的DNA甲基化含量(5.81 %)高于长翅型(2.40 %)[21].随着现代生物学技术的不断发展，有关DNA甲基化在昆虫生长发育及环境胁迫响应等过程中的功能及调控机制的研究越来越深入.

1 昆虫DNA甲基转移酶

DNA甲基化一般发生在真核基因组的胞嘧啶残基上，通过DNA甲基转移酶(DNMT)将其转化为5-甲基胞嘧啶(5-mC).哺乳动物具有完善的DNA甲基转移酶系统，包括DNMT1,DNMT2和3个DNA甲基转移酶3(DNMT3A，DNMT3B和DNMT3L)，而昆虫DNA甲基转移酶仅包括DNMT1,DNMT2,DNMT3A和DNMT3B，目前尚未发现DNMT3L[22].其中DNMT1为维持性甲基化酶，主要维持先前建立的甲基化模式[23]；DNMT3为从头合成甲基化酶，即通过从头合成方式建立新的DNA甲基化[24]；而DNMT2家族为RNA甲基转移酶，具有较弱的DNA甲基转移酶活性[23-25].

1.1 昆虫DNMTs的种类

昆虫DNA甲基转移酶的类型及数量因物种不同而有差异[26].最早是在西方蜜蜂Apismellifera中鉴定到DNMTs(DNMT1，DNMT2和DNMT3)，在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中没有鉴定到DNMT1和DNMT3[27]，在飞蝗Locustamigratoria中鉴定到DNMT1，DNMT2和DNMT3.家蚕Bombyxmori的BM-DNMT1基因保留了维持甲基化的功能，但他对金属离子的敏感性不同于哺乳动物DNMT1[22].家蚕、沙漠蝗Schistocercagregaria和赤拟谷盗Triboliumcastaneum等也只存在DNMT1和DNMT2，未鉴定到DNMT3基因[28]，因此推测家蚕和沙漠蝗的甲基化形成和维持机制有可能不同于哺乳动物，其DNMT1可能综合了哺乳动物DNMT1和DNMT3的功能[11].

对不同昆虫的DNMTs的种类及数量进行综合比较发现，除造纸胡蜂Polistesdominula和多胚跳小蜂Copidosomafloridanum外，大多数的膜翅目和全部的半翅目昆虫都有一套完整的DNA甲基化酶体系(DNMT1，DNMT2和DNMT3)；而在鳞翅目和鞘翅目昆虫中均没有发现DNMT3；双翅目昆虫中只发现了DNMT2，直翅目昆虫中均检测到了DNMT1和DNMT2(表1).

表1 不同昆虫DNMTs的种类及数量

昆虫DNMTs的结构具有一定的特殊性.与人的DNMT1相比，在家蚕和蜜蜂中鉴定到的DNMT1的C-端结构相对保守，而N-端结构则存在差异[29].人DNMT1的C-末端催化结构为6个保守的DNA结合活性基序(motifⅠ，motifⅣ，motifⅥ，motifⅧ，motifⅨ，motifⅩ).其中有2个DNA结合活性基序(motifⅠ和motifⅩ)折叠构成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)结合位点；存在于motifⅣ中的脯氨酸和半胱氨酸，可提供甲醇基辅助DNMT1的C-端催化作用[30-31]；人DNMT1的N-末端具有参与细胞内定位、催化活性调节等功能，其结构包括可结合DNA甲基化相关蛋白(DMAP1)的带电结构域、核定位信号(nuclear localization signal，NLS)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)结合位点、复制焦点靶向区域(replication focus targeting sequence，RFTS)、锌离子结合域CXXC以及2个运送DNMT1至复制叉的Polybromo结构域邻近溴代同源结构域(bromo adjacent homoloy，BAH)[32-36].在昆虫中，其DNMT1的N-末端结构无DMAP1和PCNA结合位点以及核定位信号，表明其可能与人DNMT1的作用模式不同[37].与DNMT1相比，DNMT2的C-末端催化区域更为保守，且其N-末端缺乏可变结构区域[38].昆虫的DNMT2在氨基酸长度和结构分布位置都与人的DNMT2最为接近，但研究发现果蝇DNMT2在C-末端motifⅧ的位置缺乏可结合DNA和SAM的延伸结构[38].

与DNMT1和DNMT2相比，昆虫DNMT3的研究尚不深入.不同昆虫的DNMT3仅C-端的催化区域相对保守，其他区域差异较大[37].昆虫绝大多数单拷贝的DNMT3仅存在脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸(proline tryptophan tryptophan proline，PWWP)结构域，而且仅在少数昆虫的DNMT3A中发现了锌离子结合域CXXC(ZnD)[31].

1.2 昆虫DNMTs的功能

昆虫DNMTs的功能与植物和哺乳动物存在差异.哺乳动物的甲基化主要发生在CG二核苷酸上，并且由DNMTl和DNMT3A/B催化完成[39]；植物的DNA甲基化在CG和非CG上都有可能发生，并且由DNMT3A/B的同源蛋白DRMl/2和植物特有的甲基转移酶CMT3催化非CG甲基化，而DNMT1的同源蛋白MET1可维持CG甲基化[40].昆虫DNMTs与哺乳动物的功能差异主要体现在DNMT2和DNMT3，如果蝇DmDNMT2基因的过量表达可延长果蝇生命周期，因此推测其可能与保证果蝇正常的生命周期有关[41]，哺乳动物DNMT2又称天冬氨酸tRNA甲基转移酶1，与tRNA的甲基修饰密切相关[42].蜜蜂DNMT3被抑制时，其卵和一龄幼虫倾向于发育成蜂王，还会导致参与摄食的重要基因dynactinp62的CG甲基化水平改变，因此DNMT3可能在蜜蜂营养控制等级分化过程中发挥作用[43].意大利蜜蜂Apismellifera的DNMT3可调节基因表达和选择性剪接.飞蝗的DNMT3则参与了散居型和群居型的行为转变[44].

DNMT1在昆虫性腺发生和后代存活中发挥重要作用[45-46].家蚕丢失了DNMT3的同源基因，而DNMT1优先作用于半甲基化的DNA[47]，表明DNMT1在家蚕中主要作为维持性甲基化酶发挥作用，尽管推测其可能在从头合成甲基化中也起辅助作用[48].地中海烟粉虱Bemisiatabaci的DNMT1和DNMT3则与热应激反应有关[49].

2 昆虫DNA甲基化模式和水平

在生物体内，DNA甲基化主要发生在3种位点，分别是对称的CpG和CHG位点以及非对称的CHH位点(H=C，T或A)[50].植物DNA甲基化主要发生在核基因组中近着丝粒区域的转座子、重复序列、基因间隔区和基因主体等区域的CpG,CHG和CHH位点[51].脊椎动物DNA甲基化是一种全局性的甲基化模式，即在整个基因组中都会发生[52].与脊椎动物不同，许多无脊椎动物基因组中的甲基化和非甲基化DNA近乎等量，且呈镶嵌分布[52].昆虫的甲基化分布在整个基因组中，但主要集中在昆虫保守基因区(内含子和外显子)[53]，且偏好发生于看家基因、序列保守基因及编码基因[54-55]，进而使昆虫广泛表达的基因甲基化程度明显高于特异性表达的基因[20].多数昆虫甲基化主要发生在CpG位点，如家蚕CpG甲基化在基因区中最为丰富，而转座子和启动子没有检测到甲基化[40].在沙漠蝗重复的rDNA和转座子序列中均检测到DNA甲基化，且群居和散居蝗虫神经中枢的甲基化程度存在明显差异[55].果蝇的甲基化主要发生在CpT和CpA处，但其早期基因表达并不通过DNA甲基化调控，而是受顺式调控元件、非编码RNA和miRNA以及包括多梳蛋白(pcG)和三胸蛋白复合体(trxG)在内的转录因子控制[56].

昆虫全基因组水平的甲基化程度远低于哺乳动物，目前大多数昆虫的胞嘧啶甲基化水平约为0～1 %，哺乳动物和鸟类的甲基化水平为3 %～10 %，鱼类和两栖动物的甲基化水平约为10 %，植物的DNA甲基化水平高达50 %[22].极少数昆虫可能不存在DNA甲基化，如赤拟谷盗成虫；果蝇DNA甲基化只发生在胚胎发育的早期阶段，整个基因组的胞嘧啶甲基化水平不到1 %；意大利蜜蜂的胞嘧啶甲基化水平约为0.8 %[28]；约0.11 %的家蚕DNA发生甲基化[57]；佛罗里达弓背蚁Camponotusfloridanus的基因甲基化率为0.14 %～0.16 %，印度跳蚁Harpegnathossaltator的基因甲基化率为0.11 %～0.12 %[49]；丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis雌成虫胞嘧啶甲基化率为0.18 %[46]；沙漠蝗成虫的脑和后胸神经节胞嘧啶甲基化率分别为1.3 %和1.4 %[45].到目前为止，甘蓝夜蛾Mamestrabrassicae幼虫和成虫组织甲基化水平最高，约为10 %[22].虽然昆虫的DNA甲基化水平远低于哺乳动物和植物，但越来越多的研究表明，DNA甲基化在昆虫中发挥着非常重要的作用[49].

3 昆虫DNA甲基化的作用及调控

昆虫DNA甲基化参与调控胚胎发育、基因组印记、性别决定、表型可塑性、等级分化、社会行为、滞育和杀虫剂抗性等多种生物学过程.

DNA甲基化在昆虫胚胎发育过程中发挥作用，如家蚕BmDNMTs在胚胎发育过程中尤其是在胚胎早期表达量相对较高；在经盐酸处理导致滞育终止的家蚕卵中，BmDNMTs表达水平显著升高[58].通过KEGG分析表明，甲基化可能通过调节细胞分化、代谢、凋亡和磷酸化参与调控家蚕胚胎发育[59].通过对G2/M期特异性E3泛素蛋白连接酶(G2E3)进行分析，表明基因甲基化后，磷酸化途径被激活，从而促进胚胎信号转导、物质合成等胚胎发育过程中的关键活动，推测高甲基化与胚胎滞育有关，并可能通过抑制细胞周期和细胞凋亡来调节.这些发现将有助于揭示在昆虫早期胚胎发育和昆虫滞育过程中DNA甲基化和基因表达之间的潜在联系.

DNA甲基化参与昆虫的表型可塑性.在生物体不同发育阶段，DNA甲基化存在很大差异，会对细胞的转录表达产生影响，从而影响其表型[60].对于昆虫来说，DNA甲基化可能会影响其翅型分化、等级分化等重要表型.如不同翅型的白背飞虱的DNA甲基化程度存在差异，表明 DNA甲基化可能参与调控其翅型分化[21].表观遗传机制被认为是生物体连接基因和环境的桥梁[61].营养是导致蜜蜂等级分化的关键因素[43,61].如蜜蜂的DNMT3基因被沉默后，通常会诱导工蜂发育为蜂王或蜂王样成虫，证明DNA甲基化在蜜蜂等级分化中具有重要作用[43]，也进一步证明幼虫阶段是等级分化的关键期[62].同时甲基化差异可导致保幼激素(JH)响应基因的差异表达，从而影响更多基因表达[63]，进而导致等级分化[64].

DNA甲基化在基因组印记中也发挥重要作用.基因组印记是表观遗传修饰的重要形式，可导致基因或染色体区域的改变[65].在高度社会化的二倍体有性生殖昆虫中，其基因组中来自父源和母源的基因之间存在着潜在冲突，其来源就是基因印记并涉及DNA的甲基化.在完全群居的膜翅目昆虫，基因印记在机体父源基因表达过程中发挥了重要的作用[66-67].

DNA甲基化在调控昆虫性二型过程中发挥作用.如对桃蚜Myzuspersicae全基因组甲基化模式的研究发现，雄性和无性雌性之间存在差异基因表达，且CPG甲基化是桃蚜DNA甲基化的主要形式，与其他昆虫不同的是，在基因外显子的3′端甲基化程度较高.结果显示与无性繁殖的雌性蚜虫相比，雄性的甲基化程度显著降低，但值得注意的是，雄性的X染色体基因高度甲基化.鉴于甲基化基因在性别间的表达有显著差异，Mathers等[68]认为性别偏向基因的差异甲基化在蚜虫性别分化中起作用.此外，在欧洲熊蜂Bombusimpatiens、桔粉介壳虫Planococcuscitri、印度跳蚁和佛罗里达弓背蚁等昆虫中均发现DNA甲基化模式在雌、雄成虫间存在明显不同[21,69-70]，也表明DNA甲基化可能参与性别分化的调控.

在社会性昆虫中，DNA甲基化的模式会对其行为可塑性和社会行为产生一定影响，尤其在膜翅目(蚂蚁、蜜蜂、黄蜂和叶蜂)中更为突出[71-72].蜜蜂是典型的社会性昆虫，工蜂和蜂王虽然都是经受精卵发育而来，发育的最终方向却有所不同.研究发现蜂王与工蜂的甲基化模式有很大不同，因此其分化可能是通过特定的DNA甲基化改变实现的.此外，同一蜂巢蜜蜂的分工不同，其DNA甲基化模式也有区别，如采蜜蜂和保育蜂的DNA甲基化模式存在差异[73].造纸胡蜂作为相对较为原始的社会性昆虫，在其基因组内也发现存在与其等级分化相关的特异性甲基化DNA[74].

DNA甲基化参与昆虫的免疫应答过程.用氮胞苷或地西他滨药理清除白纹伊蚊Aedesalbopictus的甲基组，蚊子表型无明显变化，但出现与应对寄生虫攻击相似的转录变化.这种变化具特异性，可导致蚊子感染负荷降低，表明DNA甲基化可能是影响其媒介能力的关键因素[75].家蚕感染胞质多角体病毒(BmCPV)后，其中肠和脂肪体中分别存在27个基因的差异表达和差异甲基化，且在被感染的中肠中，G2/M期特异性E3泛素蛋白连接酶样基因低甲基化，表明DNA甲基化可能在家蚕宿主与病毒的相互作用中起作用[76].

4 昆虫DNA甲基化的研究方法

随着基因芯片和高通量测序技术广泛应用，DNA甲基化的研究方法得到了快速发展，为表观遗传研究提供了更为有效的手段[77].目前，昆虫DNA甲基化研究主要通过2种方式进行.一是生物信息学预测，CpG O/E 密度图已成为当前预测昆虫中有无DNA甲基化存在的主要依据[37].基因序列CpG位点的甲基化水平可通过CpG O/E值(标准化的CpG含量)预测，主要利用序列中CpG的频率与C和G频率乘积的比值进行计算[37].根据该物种基因组中所有基因的CpG O/E 值进行聚类所绘制的密度图[52]可对其基因组DNA甲基化的情况进行预测[5,31,54].二是实验研究，大致可分为3类[37]：1) 甲基化特异限制性内切酶法，(methylation specific restriction enzyme assays，MSRE)主要利用对识别位点甲基化敏感性不同的限制性内切酶进行酶切，对基因的DNA甲基化程度做出初步判断[78]；2) 甲基化敏感扩增多态性技术(methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)，利用HpaII+EcoRI 和MspI+EcoRI 两组酶，对基因组DNA同时进行双酶切，从而把这个位点的甲基化信息转化为不同的酶切情况，然后与相应的接头连接，再经过2轮PCR获得条带多态性，从而确定基因组DNA甲基化水平[37]；3) 基因组DNA甲基化测序则是根据目的序列差异，将测序大致分为CpG富集和非富集2种情况，然后先经过重亚硫酸盐转化，再进行测序[37].在该方法中，重亚硫酸盐的功能是保留甲基化的胞嘧啶，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，再经PCR后转变为胸腺嘧啶，最后比较基因组序列信息和转化得到的测序信息，从而获得胞嘧啶甲基化的情况[37].

对比以上3种方法，MSRE法的优点是不需要明确靶标DNA的序列，而MSAP的优点在于不用获取物种的基因组信息，即可研究不同处理、不同种群以及不同发育阶段的甲基化模式.基因组DNA甲基化测序的优势在于通过少量样本可获得全基因组DNA甲基化信息，进而降低样本收集难度.由于酶切位点限制，MSRE法则局限在识别特定序列中CpG岛的甲基化信息.MSAP的步骤相对繁琐，同时也无法完全反映全基因组DNA甲基化的程度.基因组DNA甲基化测序则无法反映低甲基化区域的信息[37].

5 展 望

DNA甲基化是生物重要的表观遗传调控机制，在多种生物学过程中都发挥着关键作用.虽然昆虫DNA甲基化水平远低于哺乳动物和植物，但越来越多证据表明，DNA甲基化在昆虫中发挥着重要作用.近年来随着生命科学技术的不断发展，昆虫DNA甲基化的研究进展迅速，但是与植物和高等动物相比，DNA甲基化在昆虫中的研究仍有待深入.总体而言，由于昆虫种类繁多，生活环境复杂多样，昆虫DNA甲基转移酶的种类和功能、DNA甲基化模式和水平、作用及调控都具有明显特异性.因此深入研究昆虫DNA甲基化在其生长发育及多种胁迫响应过程中的作用及其调控，对系统阐明昆虫的表观遗传调控机制具有重要的理论意义.近年来，科研人员的关注点逐渐从基因序列分析层面转到表观遗传修饰，并且随着对基因功能研究方法的不断改进和完善[79]以及高通量测序技术的不断发展，表观遗传学将在单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化基础上，更多倾向于特定的DNA区域甲基化与特定表型之间的关联研究，为后续深入研究昆虫DNA甲基化功能组学提供依据；并通过定点表观遗传学改造，为明确DNA甲基化在昆虫重要生物学性状及其环境响应过程中的作用及调控机制研究奠定基础.