张艳艳，孙晓康，张晓元，袁丹丹，刘英梅，赵国敏，刘 飞

（山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室，山东 济南 250101）

有机酸是一类含有羧基的化合物，是食品中酸味的主要来源，广泛存在于水果、蔬菜和加工食品中。果蔬中的有机酸影响果蔬的色、香、味和果蔬制品的稳定性[1]；食品中的有机酸可调节口味，改善食品风味，影响食品的质量和口感[2]，加工制品中的有机酸可抑制有害菌，延长其保质期[3]。因此在产品的质量管理、生产中，有机酸的检测必不可少[4]。

有机酸检测方法通常采用气相色谱法（GC）[5]、离子色谱法（IC）[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7-9]等。其中因HPLC法操作简单、准确度高等优点，应用最广泛，且可同时测定多种有机酸。果蔬、中药及益生菌发酵果蔬汁饮品中的乙酸、草酸对其口感有一定影响。现行食品安全国家标准[10]食品有机酸（GB 5009.157-2016）测定中，可同时测定6种有机酸的含量，但并没有对草酸、乙酸、丙酮酸等有机酸的检测。本实验通过摸索优化实验方法，建立同时开展10种有机酸定性定量HPLC分析方法，灵敏度高，重复性好，对食品加工过程中控制有机酸含量、调节风味、稳定食品品质具有指导性意义。

1 材料

1.1 材料

酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸、戊二酸（色谱级，Sigma）；草酸二水合物（分析纯，阿拉丁）；甲醇（色谱纯，德国默克公司）；纯净水（娃哈哈）；KH2PO4、磷酸（分析纯，国药集团）；果汁饮品（实验室自制）。

1.2 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）；Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Legend micro 21R低温高速离心机（Thermo）；BSA1245电子天平（赛多利斯）；KQ-600E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GM-0.33A隔膜真空泵（天津津腾）；S201K pH计（梅特勒）。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 储备液配制 精确称取0.7 g草酸二水合物、0.125 g酒石酸、0.5 g丙酮酸、0.25 g苹果酸、0.5 g乳酸、0.5 g乙酸、0.25 g柠檬酸、0.625 g丁二酸、0.01 g富马酸、0.5 g戊二酸，分别用纯净水溶解，定容至5 ml，配成100 mg/ml草酸、25 mg/ml酒石酸、100 mg/ml丙酮酸、50 mg/ml苹果酸、100 mg/ml乳酸、100 mg/ml乙酸、50 mg/ml柠檬酸、125 mg/ml丁二酸、2 mg/ml富马酸和100 mg/ml戊二酸标准储备液。置于棕色瓶4 ℃储存。

2.1.2 标准溶液配制 采用0.1 %磷酸按照一定比例稀释对应的有机酸储备液，分别配成0.05 mg/ml草酸、0.5 mg/ml酒石酸、0.1 mg/ml丙酮酸、1 mg/ml苹果酸、2 mg/ml乳酸、1 mg/ml乙酸、1 mg/ml柠檬酸、2.5 mg/ml丁二酸、0.01 mg/ml富马酸、2 mg/ml戊二酸标准溶液；将有机酸储备液按一定比例混合，0.1 %磷酸定容至100 ml，配制混合标准溶液，使单独的标准溶液和混合标准溶液中同种类的有机酸的浓度相同。置于棕色瓶4 ℃储存。

2.2 色谱条件的选择

采用色谱柱：ZORBAX SB-Aq （250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：210 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；根据10种有机酸的分离情况，确定流动相中KH2PO4溶液（磷酸调pH 2.7）的浓度、甲醇含量以及色谱柱的柱温。

2.3 精密度实验

取有机酸标准溶液200 μl，按照2.2项优化后的色谱条件进行HPLC检测，连续上样6次，通过分析各有机酸的峰面积，计算峰面积的相对平均偏差（RSD）。

2.4 回收率实验

有机酸混合标样中添加已知浓度的有机酸标准溶液，按照2.2项优化后的色谱条件进行HPLC检测，每个样品重复上样6次，通过峰面积，计算各有机酸平均回收率及回收率的RSD。

2.5 果汁饮品有机酸检测

取果汁饮品1 ml，10000 r/min离心2 min，取上清，采用0.1 %磷酸稀释10倍，0.45 μm尼龙膜过滤，按照2.2优化后的色谱条件HPLC检测，连续上样3次。

3 结果与分析

3.1 色谱条件对有机酸组分分离效果的影响

3.1.1 流动相中KH2PO4溶液浓度的选择 在酸性环境中，有机酸较稳定且易被分离，参考色谱柱对pH和盐浓度的耐受范围，选择pH 2.7条件下，KH2PO4溶液浓度分别设定为5，10，20，30和40 mmol/L，结果表明，40 mmol/L KH2PO4溶液浓度条件下，苹果酸和丙酮酸有效分离，其他浓度下苹果酸和丙酮酸的峰型均有不同程度的重叠。

3.1.2 流动相中甲醇含量的选择 相同浓度KH2PO4溶液中添加不同的甲醇含量对有机酸的分离较为明显，添加甲醇浓度分别设定为2.5 %，5 %，10 %，15 %。结果表明，5 %甲醇含量条件下，各峰型分离效果最好，甲醇含量高于5 %时，乳酸、柠檬酸、乙酸峰型有部分重叠。

3.1.3 色谱柱柱温的选择 固定流动相，调节色谱柱柱温箱的温度为25，30，35，40 ℃。综合分离度和保留时间，结果表明，30 ℃时各有机酸之间的分离效果最佳。

3.2 有机酸标准曲线的建立

3.2.1 标准曲线的建立 综合上述实验结果，高效液相检测条件，流动相采用40 mmol/L KH2PO4溶液（磷酸调pH 2.7）:甲醇=95:5，柱温30 ℃；检测时间10 min。有机酸样品单独进样确定各有机酸的分离时间。混合标准溶液经0.1 %磷酸梯度稀释后进样，以有机酸浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线如表1所示，进行线性回归，10种有机酸标准曲线相关系数均大于0.999。有机酸混合标准溶液色谱图见图1。

表1 10种有机酸混合标准溶液标准曲线

图1 10种有机酸混合标准溶液色谱图

3.2.2 精密度实验 采用上述高效液相检测条件，计算同一浓度的混合标准溶液连续进样6次的各有机酸峰面积的RSD，结果见表2，各有机酸峰面积的RSD为0.82 %～2.6 %，说明该检测方法精密度良好。

表2 10种有机酸峰面积的RSD

3.2.3 回收率实验 上述高效液相检测条件，10种有机酸的回收率及相对平均偏差见图2，结果表明，平均回收率均在94 %以上，RSD不超过4 %。证明该方法的准确率较高，可用于样品有机酸的检测分析。

图2 10种有机酸回收率

3.2.4 果汁饮品有机酸检测 果汁饮品的有机酸样品，按照3.2.1项的检测方法进行HPLC检测，每个样品检测3次，取平均值，对各样品中所含的有机酸进行数据分析，结果见表3。共检出8种有机酸，其中草酸含量最高，可达4.75 g/L，各有机酸含量RSD小于0.5 %，可用于样品有机酸检测。

表3 自制果蔬汁中有机酸种类及其含量

4 结论

本研究确定了可同时检测草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸和戊二酸的HPLC方法，实现了同时对10种有机酸的有效快速分离，对比GB5009.157-2016食品中有机酸的测定方法，本文中的方法测定种类更多，用时更短。方法精确度的RSD为0.82 %～2.6 %，平均加标回收率（n=6）均在94 %以上。为检测水果、中药等有机酸的丰富度提供快速有效方法；对于食品加工过程中有机酸含量的控制、风味调节、稳定食品品质提供指导性意义，具有实用价值。