李生仪， 孙延亮， 刘选帅， 赵俊威， 赵建涛， 马春晖， 张前兵

(石河子大学动物科技学院， 新疆 石河子 832003)

世界农业土壤中磷的缺乏是影响作物生产的主要问题之一，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作为多年生优质蛋白质饲料，磷是其生长过程中需求量最大且最容易短缺的养分元素[1]。我国西北地区土壤通常为碱性，紫花苜蓿的生产性能因土壤缺磷及干旱而被限制[2]。在苜蓿实际生产中，为改善苜蓿土壤中磷素缺乏的问题，人们常通过长期施用大量化学磷肥来增加作物的吸磷量[3]，导致农业土壤中的磷大量富集，且易于与铝(Al)、铁(Fe)等元素形成金属螯合物，并与Ca2+形成不溶性磷酸盐和矿物质，致使仅有少量的磷能够被作物吸收利用。可见，过量施用磷肥不仅增加了肥料成本，并使土壤磷素富集，造成土壤环境污染[4]。因此，开展施磷量对苜蓿根际土壤微环境的研究对提高磷素利用效率进而提高苜蓿生产性能、改善土壤环境具有重要的意义。

土壤微生物在土壤-养分循环、土壤-植物间相互作用和土壤结构形成中发挥着关键作用[5]。土壤磷循环过程中，土壤微生物与土壤磷之间存在互助效应，微生物在促进土壤磷循环的同时，能高效运移不同土壤磷库中的磷[6]，并将有机和无机磷转化为适宜植物根系吸收的有效形式[7]。研究表明，长期施磷对单作苜蓿土壤微生物群落结构有显著影响，随着施磷量的增加，土壤细菌、真菌群落结构发生明显变化[8]。与此同时，土壤酶活性在土壤生态系统中也发挥着重要作用。土壤酶主要来源于土壤微生物，参与调解土壤中的生物化学过程，促进土壤内有机残留物的分解及养分循环[9]。土壤磷素利用中，土壤酶活性的变化直接或间接地影响着磷的释放进程，显著影响土壤有效磷库变化。施用磷肥在改善土壤磷含量的同时，显著改善土壤养分状况，促进根系分泌，并提高酶活性[10]。研究表明，施肥后土壤的过氧化氢酶和脲酶活性是未施肥的2.0和3.3倍[11]。但随着磷肥的施入量过多，土壤中的磷出现沉积，导致土壤酶活性降低[8]。目前，关于施磷对土壤微生物及酶活性的影响主要集中在作物及森林土壤中，而在滴灌条件下施磷对紫花苜蓿根际土壤微生物数量、根际土壤酶活性及干草产量的影响鲜见报道，尚不明确滴灌条件下不同施磷水平间紫花苜蓿根际土壤微生物数量、根际土壤酶活性、根际土壤理化性质及干草产量间的关系。

因此，本研究通过探究不同施磷水平对紫花苜蓿根际土壤微生物数量和根际土壤酶活性的影响，阐明不同施磷水平下紫花苜蓿根际土壤微生物数量、根际土壤酶活性的动态变化特征、苜蓿根际土壤理化性质及干草产量的变化规律，明确各指标与苜蓿干草产量之间的内在联系，以期在生产实践中为苜蓿优质高效生产及科学合理施磷提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020年在石河子大学牧草试验站(44°20′ N，88°30′ E)进行，试验地土壤类型为灰漠土，耕层(0～20 cm)土壤基础理化性质见表1。

表1 试验地土壤基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of test soil

1.2 试验设计

本研究采用单因素完全随机设计，设置4个施磷肥(P2O5)梯度：0(P0)、50(P1)、100(P2)和150 kg·hm-2(P3)，各处理做3次重复，所用磷肥为磷酸一铵(含P2O552%，N 12.2%)。各处理苜蓿分别于返青后的营养生长初期及各茬次刈割收获后3～5 d施加对应水平的磷肥，采用滴灌模式随水滴施，具体施肥时间分别为2020年5月9日、5月30日、7月6日及8月12日，单次施肥量为当年施肥总量的25%。为保证试验仅受磷肥的影响，通过施加尿素抵消含氮肥的磷酸一铵对试验的影响，以保持试验的一致性，具体施肥情况如表2所列。

表2 施肥配比Table 2 Fertilizer proportion

本研究供试紫花苜蓿品种‘WL366HQ’于2019年4月29日播种。采用条播方式播种，播种量为18.0 kg·hm-2，播种深度为2.0 cm，行间距为20 cm，小区面积为24 m2(4 m×6 m)。滴灌带浅埋于地表10～15 cm处，滴灌带间距为60 cm，所用滴灌带为内镶式滴灌带(北京绿源有限公司生产)，滴头间距为20 cm。田间管理除施肥因素外，其余均按当地滴灌苜蓿高产田进行。

1.3 土壤样品采集

采用抖根法在紫花苜蓿最后一茬刈割(2020年10月4日)后进行根际土取样，具体方法为：每个小区随机选取长势均匀一致的紫花苜蓿3株，挖出苜蓿植株根系(60 cm深)，抖掉与根系结合松散的土壤，然后用酒精灯火焰灭菌过的镊子将附着在植株根系表面的土壤轻轻刮下作为根际土。将得到的根际土迅速放入冰盒中保存，带回实验室后保存于4℃冰箱冷藏备用。

1.4 测定指标及方法

苜蓿根际土壤微生物数量采用平板计数法培养计数，细菌、真菌以及放线菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基、马丁琼脂培养基和改良高氏1号培养基培养计数。苜蓿根际土壤酶活性采用北京索莱宝科技有限公司所提供的土壤脲酶、土壤碱性磷酸酶、土壤过氧化氢酶活性检测试剂盒测定。

土壤全磷和有效磷分别采用硫酸-高氯酸消煮法及NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定[12]。土壤含水率采用烘干法测定[12]。土壤pH利用酸度计(PHS-3C，上海雷磁)进行测定。

苜蓿干草产量测定：在每茬苜蓿初花期(开花5%左右)采用样方法(1 m×1 m)测定，随机选取苜蓿植株(长势均匀一致且能够代表该小区长势)，控制留茬高度5 cm刈割苜蓿植株，称重，重复3次；另取300 g鲜草样品各3份装于白色布袋带回实验室进行苜蓿植株含水率测定，在105℃下杀青30 min后，于65℃烘干至恒重，测定其干物质含量并计算苜蓿干草产量(t·hm-2)。具体计算公式如下：

干草产量=鲜草产量×(1-含水率)

(1)

1.5 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016软件进行数据整理，用SPSS 17.0对真菌、放线菌、细菌数量和土壤脲酶活性、土壤过氧化氢酶活性及土壤碱性磷酸酶活性进行方差分析，并采用Duncan法进行处理间的差异性比较，同时利用SPSS 17.0进行相关性和主成分分析。采用Origin 2019绘图。

2 结果与分析

2.1 不同施磷水平下苜蓿根际土壤微生物数量的动态变化

苜蓿根际土壤微生物数量在不同施磷水平下具有明显变化(图1)。真菌和放线菌的数量随着施磷量的增加均呈先增加后降低趋势，均在P2处理(100 kg·hm-2)达到最大值。不同施磷量条件下，苜蓿根际土壤真菌数量为P2处理显著高于其他施磷处理(P<0.05)，与P0处理相比，P2处理下苜蓿根际土壤真菌数量提高了3.85%，相较P1和P3处理，P2处理下苜蓿根际土壤真菌数量分别提高了1.57%和5.14%。苜蓿根际土壤放线菌数量在P2处理达最大值6.15 lg cfu·g-1，显著高于其他处理(P<0.05)，且各处理间均差异显著(P<0.05)，与其余处理相比，P2处理下苜蓿根际土壤放线菌数量提高了1.90%～5.67%。随着施磷量的增加，苜蓿根际土壤细菌数量逐渐增高，在P3处理(150 kg·hm-2)下达到最高值，显著高于P0，P1和P2处理(P<0.05)，且分别高出了10.59%，4.61%和1.49%。

图1 不同施磷水平下苜蓿根际土壤微生物数量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of microbial quantity in rhizosphere soil of alfalfa under different phosphorus levels注：不同小写字母表示施磷处理间差异显著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate a significant difference between different treatments at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同施磷水平下苜蓿根际土壤酶活性的动态变化

不同施磷水平下苜蓿根际土壤酶活性变化明显(表3)。随着施磷量的增加，苜蓿根际土壤碱性磷酸酶活性呈先增高后降低趋势，在P1处理(50 kg·hm-2)达到最大值，显著高于其他处理(P<0.05)，且各处理间均差异显著(P<0.05)，分别显著高于P0处理69.17%、P2处理15.47%及P3处理69.49%(P<0.05)。苜蓿根际土壤脲酶活性及过氧化氢酶活性随着施磷量的增加，均在P2处理(100 kg·hm-2)达到最大值，随后开始逐渐降低。苜蓿根际土壤脲酶活性在P2处理时显著高于其余施磷处理10.98%～46.35%(P<0.05)；苜蓿根际土壤过氧化氢酶活性在P2处理显著高于其他处理(P<0.05)，与P0，P1及P3处理相比，P2处理下苜蓿根际土壤过氧化氢酶活性分别提高了3.22%，1.63%及3.48%。

表3 不同施磷水平下苜蓿根际土壤酶活性的变化Table 3 Changes of soil enzyme activity in alfalfa rhizosphere under different phosphorus levels/U·g-1·d-1

2.3 不同施磷水平下苜蓿根际土壤理化性质的变化

苜蓿根际土壤理化性质在不同施磷水平下具有明显变化，苜蓿根际土壤含水率及pH随施磷量的增多而逐渐降低，苜蓿根际土壤全磷及有效磷含量随着施磷量的增多呈逐渐增多趋势(表4)。不同施磷量条件下，苜蓿根际土壤含水率在不施磷(P0)时显著高于其他处理(P<0.05)，与其他处理相比较，施磷量为150 kg·hm-2(P3)时土壤含水率最低，为14.30%，分别显著低于P0处理23.29%、P1处理11.31%和P2处理6.91%(P<0.05)；苜蓿根际土壤全磷含量在施磷量为150 kg·hm-2(P3)时达最大值，为0.81 g·kg-1，显著高于P0处理26.56%、P1处理15.71%(P<0.05)，但与P2处理差异不显著(P>0.05)；苜蓿根际土壤有效磷含量在施磷量为150 kg·hm-2(P3)时达最大值，为20.82 mg·kg-1，显著高于P0处理54.57%(P<0.05)；苜蓿根际土壤pH在P0处理显著高于其余施磷处理(P<0.05)，当施磷量达150 kg·hm-2(P3)时，土壤pH最低，为7.23，分别显著低于其他施磷处理0.96%～4.74%(P<0.05)。

表4 不同施磷水平下苜蓿根际土壤理化性质Table 4 Physical and chemical properties of alfalfa rhizosphere soil under different phosphorus levels

2.4 不同施磷水平下苜蓿的干草产量

苜蓿干草产量在一定施磷量下具有明显变化(图2)。苜蓿干草产量在不施磷(P0)处理下最低，为19.54 t·hm-2，显著低于其余处理(P<0.05)。持续提高施磷量，苜蓿干草产量逐步增加，直至施磷量达100 kg·hm-2(P2)时其干草产量达到最大值，为21.82 t·hm-2，分别显著高于P0处理11.67%和P1处理4.28%(P<0.05)。当苜蓿土壤施磷量达150 kg·hm-2(P3)时，苜蓿干草产量反而下降，且显著低于P2处理1.00%(P<0.05)。

图2 不同施磷水平下苜蓿的干草产量Fig.2 Hay yield of alfalfa under different phosphorus levels

2.5 不同施磷水平下苜蓿根际土壤微生物数量、酶活性及土壤理化性质与干草产量的相关性分析

施磷肥后苜蓿根际土壤微生物数量和酶活性及土壤全磷含量与苜蓿干草产量的相关性分析如表5所示。根际土壤细菌、真菌及放线菌数量均与根际土壤碱性磷酸酶、脲酶、过氧化氢酶活性呈正相关，其中根际土壤细菌、真菌和放线菌数量两两间均呈正相关，且根际土壤真菌与放线菌数量显著正相关(P<0.05)，根际土壤放线菌与细菌数量极显著正相关(P<0.01)；根际土壤真菌数量与根际土壤碱性磷酸酶、脲酶、过氧化氢酶活性呈极显著正相关(P<0.01)，根际土壤放线菌数量与根际土壤脲酶、过氧化氢酶活性极显著正相关(P<0.01)，根际土壤细菌数量与根际土壤脲酶活性呈极显著正相关(P<0.01)；根际土壤碱性磷酸酶、脲酶及过氧化氢酶活性间均呈极显著正相关(P<0.01)。苜蓿干草产量与根际土壤细菌、放线菌数量及脲酶活性、土壤全磷、有效磷含量呈极显著正相关(P<0.01)，与土壤过氧化氢酶活性呈显著正相关(P<0.05)，与真菌数量及碱性磷酸酶活性呈正相关，而与土壤含水率及土壤pH呈极显著负相关(P<0.01)。

图3 不同施磷水平下苜蓿根际土壤微生物数量、酶活性及土壤理化性质与干草产量的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of rhizosphere soil microbial quantity,enzyme activity,soil physical and chemical properties and hay yield of alfalfa under different phosphorus application levels注：图中*表示相关性显著(P<0.05)，**表示相关性极显著(P<0.01)Note：*and** indicate significant correlation at the level of 0.05 and 0.01,respectively

2.6 不同施磷水平下苜蓿根际土壤微生物数量、酶活性、土壤理化性质及干草产量的主成分分析

在相关性分析的基础上，对不同施磷水平下苜蓿根际土壤微生物数量、酶活性、土壤理化性质及干草产量进行主成分分析(图4)。分析得出，PC1(Principal component 1，PC1)的方差贡献率为71.36%，PC2(Principal component 2，PC2)的方差贡献率为25.20%，PC1和PC2的综合方差贡献率为96.56%。随后计算各主成分的特征向量，最终加权计算(表5)，综合评价分值越高，则为最适宜施磷处理。结果表明，其评分从高到低的排序为P2>P1>P3>P0处理，综合评价P2处理为最优处理，可见，当施磷量为100 kg·hm-2(P2)时效果最优。

表5 苜蓿根际土壤微生物数量、酶活性、土壤理化性质及干草产量的综合评价Table 5 Comprehensive evaluation of microbial quantity,enzyme activity,soil physical and chemical properties and hay yield in alfalfa rhizosphere soil

图4 不同施磷水平下苜蓿根际土壤微生物数量、酶活性、土壤理化性质及干草产量的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of rhizosphere soil microbial quantity,enzyme activity,soil physical and chemical properties and hay yield of alfalfa under different phosphorus levels

3 讨论

3.1 苜蓿根际土壤微生物数量对不同施磷水平的响应

土壤原生微生物群落和其代谢功能与土壤磷素变化具有密切关系，在有机物分解、改变土壤酶活性和养分循环等方面发挥着重要作用。将磷素引入土壤会影响该区域微生物群落的组成，使土壤环境发生改变[13]。其中，细菌作为土壤中数量最多、种类最丰富的微生物，参与有机质的动态变化和养分循环[14]。研究表明，施磷在直接为土壤提供养分的同时能够改变土壤pH，进而影响细菌群落的组成[15]。本研究结果表明，通过增施磷肥能够显著增加苜蓿根际土壤细菌数量，这主要是因为施入磷肥使土壤的有效磷含量发生变化，在为微生物生长提供磷素营养的同时，促进植物生长并产生更多的植物根系分泌物，从而提高根际土壤细菌的多样性及丰度[16]。放线菌普遍存在于土壤生态系统中，具有固氮及对死亡有机物的循环利用作用[17]。本研究中，磷肥施入量的增加明显提高了苜蓿根际土壤放线菌数量。研究表明，外源性的磷肥能够促使微生物快速吸收土壤中的磷，协同微生物细胞内富集更多的多聚磷酸盐，从而促进微生物的增殖[18]。由于放线菌适宜生存在微碱性及透气性良好的土壤中，但继续提升磷肥施入量，土壤pH降低，破坏了放线菌生长的最有利条件，致使其生长被抑制[19]。真菌作为田间土壤中常见的微生物，在促进土壤中有机质的转化、改善植株生长发育情况及调控作物病害等方面具有极其重要的作用[20]。陈露等[21]研究发现，随着磷肥的施入，真菌群落结构改变，土壤真菌数量与磷肥施入量呈负相关。本研究结果表明，随磷肥的施入量增加，苜蓿根际土壤真菌数量呈现出先增加后降低的趋势。这主要是因为真菌宜生存于有机物难分解，营养含量低的环境，因此低磷土壤更宜于真菌生长，而在高磷土壤中的真菌数量则开始趋于降低[22]。同时，磷肥的施入改变了土壤中的微环境及物种变化，以真菌为营养来源的动植物数量升高，从而导致真菌数量及多样性降低[20]。

3.2 苜蓿根际土壤酶活性对不同施磷水平的响应

土壤酶活性是土壤肥力的传感器，其活性水平反映了土壤中的生物活性和生化反应，也是土壤肥力的重要指标[9-10]。研究表明，充足的磷肥供应有利于苜蓿根系的良好发育并产生更多的根系分泌物，进而促进土壤酶活性的提高[23]。其中，土壤磷酸酶是由微生物细胞和植物根系分泌产生的，其活性对植物磷的有效性、有机磷肥料的有效性和土壤磷循环具有重要的影响[24]。本研究中，随施磷量的增加，苜蓿根际土壤碱性磷酸酶活性先增加后降低，这主要是因为磷肥的介入提高了土壤微生物的丰度，导致微生物对磷的摄入量增加，根区及非根区中可利用磷素含量降低，刺激微生物和动植物分泌产生更多碱性磷酸酶[25]。然而，过量的磷肥会导致碱性磷酸酶活性下降，主要是由于在碱性磷酸酶活性变化过程中存在“诱导-抑制”机制，无机磷含量的增高与碱性磷酸酶活性呈成负相关[26]。研究表明，土壤中过氧化氢酶活性与土壤性质存在密切联系，作为H2O2清除系统中极其重要的生物酶，其活性在一定程度上表征了土壤总生物活性及土壤的生物氧化过程[27]。本研究中施加磷肥，土壤过氧化氢酶活性提高，但随着施磷量的增加，过氧化氢酶活性开始降低。由于碱性土壤对根区的不利影响会加速微生物的氧化胁迫，提高过氧化氢酶活性，当pH降低至一定水平时，土壤过氧化氢酶活性略有下降[11]。土壤脲酶是有催化功能的活性物质，与土壤中微生物数量、全氮及有机质含量存在密切联系，并深刻影响土壤动植物对氮的获取，其活性与土壤供氮能力有紧密联系[28]。本研究中，随着磷肥施入量的增多，土壤脲酶活性逐渐升高。磷肥的增施有效缓解土壤中磷素匮乏的限制，进一步增加土壤微生物的丰度及活性，进而显著提高土壤脲酶活性[29]。磷肥施入在促进苜蓿植株生长的同时，促进了土壤中氮被植株大量利用，导致土壤氮含量匮乏，而氮含量与土壤脲酶活性的关系密切，因此植株需通过其根系及根区微生物分泌更多的脲酶来获取更多的氮[29]。但是，持续增加施磷量致使土壤脲酶活性降低，这可能是因为土壤中磷肥的施入促使大量氮素被利用，致使土壤中不可用氮的含量过高，脲酶的酶促反应被抑制而活性降低[30]。

3.3 苜蓿干草产量对不同施磷水平的响应

干草产量作为牧草生长速度、株高及茎粗的综合表现，能够直观的体现牧草的生产性能。施入磷肥可以提高土壤对植物的有效性，能够有效弥补土壤缺磷造成的植株生产力受限[31]。本研究结果表明，磷肥的施入能够有效提高苜蓿干草产量，但随着施磷量的持续增高，苜蓿干草产量开始降低。磷肥在一定的区间范围内能够有效提高苜蓿的生产性能，但过量的磷肥施入会导致苜蓿生产性能降低，与不施磷肥相比，苜蓿干草产量随着磷肥的施入呈现先增高后下降的趋势，增产率区间为14.8%～23.2%[32]。研究表明，施磷在有效促进植物体内磷素积累的同时能够增大苜蓿的叶面积指数，提高苜蓿的光合效率，促进植株的生长和物质积累，进而提高紫花苜蓿产量，但磷肥施用过量，会使磷素在植物营养器官中过度富集，造成干物质积累受到抑制[33-34]。同时，过量施磷会破坏土壤中磷素吸收与分解的平衡，导致苜蓿根系磷素吸收超过阈值，磷素利用率不再增加，干草产量降低[35]。

4 结论

适宜施磷量能够有效改善根际土壤微环境。随着施磷量的增加，紫花苜蓿根际土壤微生物数量增多，酶活性及干草产量提高。当施磷量过高，除根际土壤细菌数量增多外，其余微生物数量均减少，酶活性及干草产量有所降低。通过综合评定，施磷(P2O5)量为100 kg·hm-2时，能够显著改善根际土壤微环境，提高紫花苜蓿干草产量。