吕经纬，李春楠，李 光，张楠茜，张凯月，边学峰，张 辉, ，孙佳明,

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林长春 130117；2.长春中医药大学医药信息学院，吉林长春 130117）

随着人口老龄化发展，骨质疏松症（osteoporosis，OP）已成为世界上第七大常见疾病[1]，给医疗和社会造成严重的负担[2]。研究表明骨质疏松的发生发展和饮食息息相关[3]，采用药膳食疗法改善骨质疏松症越来越受到认可。Tseng等报道异黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松等作用[4-5]，异黄酮可提高骨密度，提高血清骨形成指标水平，促进骨质疏松大鼠骨形成[6]。作为纯天然的植物提取物，异黄酮具有活性好、安全性高、来源广泛、毒性低等特点，在药品、保健品、功能食品及化妆品行业具有重要的用途[7]。

鸡血藤为豆科植物密花豆（Spatholobus suberectusDunn）的干燥茎藤，主要来源于广东、广西等省，被广泛用作茶、酒和汤的食品添加剂[8]，具有行血补血、通经活络、强壮筋骨之功效[9]，在传统医学治疗骨质疏松中有着悠久的历史[10]。研究表明，鸡血藤中含有大量的异黄酮[11]，具有促进成骨细胞合成和分泌碱性磷酸酶的作用[12]，其提取物对胎鼠尺骨和挠骨的生长有促进作用[13]。曹辉等[14]报道以鸡血藤为君药的藤黄健骨胶囊具有治疗骨质疏松的作用，能够抑制骨质吸收、促进成骨细胞形成和骨的重建。但鸡血藤治疗骨质疏松症的机制尚不明确，因此，研究鸡血藤活性成分治疗骨质疏松的分子机制具有重要意义。以往的研究表明，植物来源有效成分中大多数研究集中在单一成分与抗骨质疏松活性的关系上，而揭示天然产物与细胞蛋白之间复杂的相互作用以及对人体功能的影响未见报道。本研究基于网络药理学构建“成分-靶点-通路”网络模型，并应用分子对接验证分析，筛选出鸡血藤抗骨质疏松的有效成分与关键靶点，为寻找植物来源的天然化合物抗骨质疏松的保健食品开发提供快速、高效筛选的方法参考。

1 资料与方法

1.1 数据准备

从TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库和文献[15-20]中收集鸡血藤14个有效成分的化学结构信息，包括黄酮类和酚酸类（见表1），所有化合物均从NCBI PubChem数据库（http://www.NCBI.nlm.nih.gov/pccompound/）下载并保存为sdf格式文件，提交至PharmMapper数据库，参数和最大生成构象分别设置为ON和300，在高级选项中选择“仅人类蛋白质靶点（v2010，2241）”，其他选项设为默认值[21-24]，采用统计方法和反向对接技术来识别化合物的潜在靶点，最后选择z’-score＞1[25]的匹配靶点进行综合网络药理学分析。

1.2 网络构建和拓扑分析

将PharmMapper数据库筛选出的靶点去重后，通过使用检索/ID映射（http://www.uniprot.org/uploadlists/）将靶点转换为UniProtKB标识符用于以下网络构建和拓扑分析。通过Cytoscape 3.7.2软件[26]构建14个化合物与PharmMapper靶点相互作用网络，可视化分析之间存在的联系，并对成分-靶点网络进行GO生物学注释和KEGG富集分析，以确定鸡血藤抗骨质疏松作用的关键通路。Clue GO插件用于分析生物网络中注释和功能组之间的相互关系，并对关键网络进行深入的探索。在ClueGO操作界面中，删除重复节点，将UniprotKB导入智人列表，Go-tree区间为5～10，kappa评分为0.4，P值为0.01，ClueGO结果仅显示GO生物过程和KEGG信号通路。

为了筛选复杂富集网络中的关键靶点和通路，利用CytoNCA插件计算节点的中心性。CytoNCA提供了8种中心性（介数、接近中心性、自由度、特征向量中心性、平均最短路径长度、网络中心性、子网络中心性和信息中心性），本研究分别选取介数、接近中心性和子网络中心性的前10%的节点，通过三个中心性的重叠，生成具有关键靶点的子网络。

1.3 分子对接

虽然通过各种生物过程和信号通路中的蛋白质能够筛选出一些药物，但是化合物和蛋白质的结合可能较弱。同样，鸡血藤中的一些化合物可能与关键蛋白质结合较弱，为了剔除这些蛋白质和化合物，故进行了基于分子对接的虚拟筛选。

利用AutoDock 4.2软件进行分子对接，研究潜在靶点与化合物的结合能力。将表1中14个化合物的配体分别导入软件中，与从RCSB蛋白质数据库（http://www.RCSB.org/pdb/home/home.do）下载KEGG通路中的靶蛋白进行对接，根据相关文献报道[27-28]，参数设置为：Grid Box坐标（4DMX：-6.875，2.256，10.836），盒子大小为40×40×40个网格点；（4MXO：11.896，-36.649，-6.446），盒子大小为60×40×40个网格点，运行次数为100，其他参数采用软件的默认设置，采用拉马克遗传（Lamarckian genetic algorithm）算法评价配体与受体的结合能。采用Pymol、Ligplus软件对分子对接结果进行分析与展示。

表1 鸡血藤的14个有效成分Table 1 14 active ingredients of Spatholobi Caulis

2 结果与分析

2.1 网络构建

文章整体架构见图1。鸡血藤14个化合物从PharmMapper数据库获得601个靶点，筛重后通过检索/ID映射（http://www.uniprot.org/uploadlists/）转换为221个UniProt KB标识符用于以下富集分析。应用Cytoscape 3.7.2软件构建化合物-靶点网络，生成的网络包含235个节点和601条边，如图2所示，化合物越大，表明结合的靶点越多，化合JXT-02、JXT-03、JXT-06、JXT-10、JXT-11和JXT-13在网络中的degree值大于其他化合物，显示出了更强的多重交互结合靶点作用，主要包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC，UniProtKB：P12931）、组织蛋白酶K（CTSK，UniProtKB：P43235），中性粒细胞胶原酶（MMP8，UniProt KB：P22894）和雌激素受体（分别为ESR1、ESR2、NCOA5，UniProt KB：P03372、Q92731、Q9HCD5），这些蛋白质都参与骨质疏松和代谢反应，该网络揭示了鸡血藤的14个成分对骨质疏松的蛋白质靶点或生物途径有联合作用。

图1 基于网络药理学和分子对接的整体框架Fig.1 Overall framework based on network pharmacology and molecular docking

图2 14个化合物与601个靶点网络Fig.2 14 compounds and 601 target network

2.2 富集分析

将221个靶点导入ClueGo插件得到靶点生物过程网络（456个节点和5723条边）和KEGG信号通路网络（124个节点和365条边）（图3a～3b），选用3个中心性度值筛选核心子网络（图3c～3d），在同一颜色组中包含了密切相关的靶点。

中草药治疗疾病的特点具有多成分相互配合、协同增效的作用。研究表明鸡血藤不同成分以相互连接的生物网络中不同节点为目标，这些节点具有相似的功能，而针对这一个相互关联的生物网络为目标的治疗方式有利于避免旁路激活引起的耐药性。

在GO生物过程子网络（包含15个节点和47条边）中，15个靶点注释均与大量生物过程显着相关，包括蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、核苷磷酸代谢过程、核苷酸代谢过程、MAPK级联反应的正调控、调节蛋白激酶活性、含核碱基的小分子代谢过程和有机磷酸酯的生物合成过程（表2，图3c）；KEGG信号通路子网络（包含10个节点和9条边）包含流体剪切应力和动脉粥样硬化、细胞色素P450对异生物的代谢、嘧啶代谢和药物代谢等信号通路（表3，图3d），此外，KEGG信号通路子网络还揭示了与癌症的关系。我们发现，由于骨质疏松反应不可避免地伴随着代谢反应，因此绝大多数靶点本体注释和KEGG信号通路都与机体代谢系统有关，因此，利用该子网络来分析鸡血藤抗骨质疏松作用的机制是可行的。

表2 生物过程子网络Table 2 Biological process sub-network

表3 KEGG信号通路子网络Table 3 KEGG signal path sub-network

在靶点生物过程和KEGG信号通路富集分析的结果中，大量的必需靶点与代谢信号通路或生物过程相关（图3c～3d），表明鸡血藤抗骨质疏松可能与代谢异常有关。

骨质疏松代谢相关的生物过程包含多条信号通路[29]，而流体剪切应力和动脉粥样硬化、细胞色素P450对异生物的代谢等信号通路中的SRC、CTSK等靶点在调控骨质疏松中发挥了至关重要的作用[30-31]。关于骨代谢，SRC在破骨细胞中表达的水平比其他细胞高5～200倍[32]，SRC激酶已被证明可以通过细胞信号传导和生化调节促进破骨细胞的分化和激活，从而导致骨吸收增加[33]，因此SRC蛋白激酶抑制剂是治疗骨质疏松症的药物靶点。另外，与破骨细胞相关的CTSK表达上调引起关节周围骨量下降，尤其是股骨末梢干骺端的骨质流失[34]，因此，抑制组织蛋白酶K表达可以降低骨质流失。以上研究与本网络药理学预测的KEGG信号通路富集网络的结果一致（图3d中橙色和紫色）。

图3 鸡血藤预测靶点的生物过程网络Fig.3 Biological process network of the predicted target of Spatholobi Caulis

图3d中的蓝色是叶酸生物合成代谢通路，叶酸在体内存于肠壁、肝、骨髓等组织中，被叶酸还原酶还原成具有生理活性的四氢叶酸并参与嘧啶的合成，对正常红细胞的形成有促进作用。这与中医对鸡血藤活血作用的描述一致。

在KEGG子网络中，流体剪切应力和动脉粥样硬化、细胞色素P450对异生物的代谢信号通路进一步划分并置于同一组中（图3d）。在KEGG信号通路分析的结果中，关键靶点SRC是通过流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路直接参与骨代谢发挥的作用（条目：hsa:05418，图3d中浅紫色），同时，调节蛋白激酶活性生物过程（条目：GO:0045859，图3c中浅蓝色）也出现在靶点富集分析中协同发挥作用。此外，在KEGG富集分析中，细胞色素P450对异生物的代谢信号通路（条目：hsa:00980，图3d中橙色）也被认为是必不可少的通路，因为该通路中的CTSK对于调节骨吸收至关重要。可以推测鸡血藤通过影响上述信号通路调节了骨代谢反应并治疗骨质疏松。

综上所述，抑制破骨细胞的生物过程在骨质疏松和代谢调节中起着至关重要的作用，而流体剪切应力和动脉粥样硬化、细胞色素P450对异生物的代谢信号通路是生物过程的关键。将KEGG子网络靶点筛重后，选择PharmMapper数据库筛选出的、并富集在上述信号通路中的2个蛋白作为进一步对接研究的靶点：SRC（PDBID：4MXO）和CTSK（PDBID：4DMX）。故提示鸡血藤14个化合物通过靶向影响破骨细胞分化成熟的关键靶点调控流体剪切应力和动脉粥样硬化、细胞色素P450对异生物的代谢信号通路，进而表现出抗骨质疏松作用。

2.3 分子对接

鸡血藤14个化合物的对接结果见表4，两个关键靶点（4MXO和4DMX）的平均对接得分为-6.32和-5.47，提示与原配体具有相似的结合能力（-7.67和-6.87）。结果表明，鸡血藤14个化合物通过2条KEGG信号通路（流体剪切应力和动脉粥样硬化、细胞色素P450对异生物的代谢信号通路）中的2个关键靶点协同发挥抗骨质疏松的作用。

采用AutoDock 4.2进行分子对接，根据蛋白质与配体之间相互作用的结合能选择评分函数，分别得到每个化合物和受体的对接得分，得分越低，配体与受体结合越稳定[35]，结果见表4。为了筛选出能够与关键靶点具有较好结合能力的化合物，对14个化合物与2个靶点的结合能进行了研究。在抗骨质疏松级联反应中，按照对接分数降序排列，筛选出化合物-靶点复合物。最后，从表4中挑选出与初始配体结合能相近的前2名对接结果，其中樱黄素（JXT-13）和甘草素（JXT-06）与靶位点SRC和CTSK的结合能力强。研究表明，樱黄素（JXT-13）可以通过抑制破骨细胞增殖来对骨质疏松小鼠起保护作用[36]；甘草素（JXT-06）能抑制破骨细胞形成和骨吸收活性缓解类风湿性关节炎的骨破坏[37]，说明上述化合物对抗骨质疏松有效。SRC作为流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路中的下游成员，SRC激酶刺激破骨细胞生成并激活，从而导致骨吸收增加，引发骨质疏松形成。因此，选择复合物JXT-13/4MXO和JXT-06/4DMX（分别为-7.63和-6.31）进行进一步的对接分析研究，以分析抑制剂的结合能力。

表4 鸡血藤14个成分与SRC和CTSK靶点结合打分排序表Table 4 Molecular docking results of 14 compounds from Spatholobi Caulis with SRC and CTSK

复合物JXT-13/4MXO和JXT-06/4DMX的配体相互作用分别见图4b、4d，图5b、5d。在图4a、4c中，内置配体是SRC的抑制剂，通过3个氢键与处于活化状态的Abl蛋白的活化环结合，其中两个氢键位于ATP结合位点的铰链区，另一个将内置配体氨基的氮原子与蛋白的Met341氨基酸上羟基的氧原子相连接，从而抑制酪氨酸激酶的活性[27]。在图4b中可以看到化合物JXT-13的酚基和Glu310、Thr338、Phe405、Glu339和Met341之间存在相互作用的氢键。Met341与作为主链受体的内置配体嘧啶形成氢原子，与复合物JXT-13/4MXO中的羟基具有相似的相互作用。此外，两个配体周围的氨基酸（Met341、Thr338、Tyr340、Ala293、Leu393、Leu273、

图4 活性成分与SRC的对接模式Fig.4 Molecular docking pattern of bioactive compounds with SRC main protease

图5 活性成分与CTSK的对接模式Fig.5 Molecular docking pattern of bioactive compounds with CTSK main protease

Clu310和Clu339）几乎相同，表明化合物JXT-13和内置配体对SRC具有相似的抑制作用。在图5中，组织蛋白酶K抑制剂和化合物JXT-06在活性口袋中与周围的氨基酸形成了相似的相互作用，这些抑制剂对酶活性抑制的作用机制都是利用抑制剂小分子的突触基团直接与酶分子中Cys25位的巯基形成共价健，并依靠其它位点所形成的多个氢键和疏水键相互作用进一步稳固它们之间的这种结合，从而使酶失去活性。同时，两个配体周围的氨基酸（Asn161、Cly66、Leu209、Leu60、Cly64、Trp26和Gly65）几乎相同，化合物JXT-06可能通过这些周围氨基酸与组织蛋白酶K抑制剂表现出相同的作用。化合物JXT-13的结果与化合物JXT-06相似，其酚羟基与4MXO、4DMX形成新的相互作用氢键，表明这两个化合物对靶点SRC和CTSK具有较强的结合能力。

3 结论

综上所述，SRC和CTSK可能为鸡血藤治疗骨质疏松症的核心靶点，分别与樱黄素、甘草素等有效成分以氢键、疏水作用力等连接发挥治疗作用。本研究基于网络药理学构建“成分-靶点-通路”网络模型，并应用分子对接验证分析，具有快速、高效筛选成分、靶点的作用。同时，该方法对鸡血藤治疗骨质疏松症的作用机制进行了多维度、多层次分析，并对鸡血藤的临床应用具有积极意义，可为揭示中医思维的科学价值提供理论支撑。此外，本实验室将依据实验结果开展体内、外生物学实验，进一步为鸡血藤治疗骨质疏松症提供实验依据。