刘阳泰，胡丽丽，白 莉，王晔茹，董庆利，王彝白纳,

（1.上海理工大学，上海 200093；2.国家食品安全风险评估中心，北京 100022）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种兼性厌氧的革兰阳性杆菌，可在低温、高盐与低酸等环境下生长存活[1]。该菌可通过污染肉制品、奶制品、即食食品等进行传播，对于孕妇、婴幼儿及免疫力低下人群具有较高的致病性，是目前危害公众健康的主要食源性致病菌之一[2]。

我国监测结果表明，家庭、餐馆和食堂是食源性疾病事件发生最常见的场所[3]。通过采样分析发现，厨房器具设备，如案板、水槽、冰箱等各类表面的微生物污染情况较复杂，其中包含单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等多种病原微生物[4-5]。因此，食源性致病菌可能存活定殖于厨房的食品接触表面，再因食物处理者操作不当，导致污染表面与食物接触发生再污染或交叉污染，从而增加发生食源性疾病的风险[6-9]。基于此，近年围绕病原体在刚性表面存活情况的研究逐渐增多，主要集中在致病菌的种群数量及抗逆性变化等方面[10-12]。针对单核细胞增生李斯特菌，目前已知决定或影响其接触表面生理生态情况的因素主要包含菌株类型、环境温湿度、营养状态等[13-15]。同时，部分学者观测发现，接触表面材质的类型，可能也是影响单核细胞增生李斯特菌及其他病原体存活能力的重要因素之一[16-18]。因此，有必要开展单核细胞增生李斯特菌在不同材质接触表面的存活情况对比观测和建模研究。

本研究选取7种家庭厨房典型食品接触材质，即不锈钢、木、铝、玻璃、聚丙烯塑料、PMMA塑料（又称亚克力）、ABS塑料，探究单核细胞增生李斯特菌在4 ℃（冷藏）和25 ℃（室温）条件下的存活能力，并应用线性模型对单核细胞增生李斯特菌的存活过程进行定量描述和比较。该研究旨在为解释单核细胞增生李斯特菌的污染持久性提供科学依据，为精准量化单核细胞增生李斯特菌的暴露可能性提供基础参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

单核细胞增生李斯特菌菌株（L. monocytogenesATCC 7644） ST122/CC9型，上海帆研生物科技有限公司；含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂（Tryptic Soy Agar with Yeast Extract，TSA-YE）、含 0.6% 酵母膏的胰酪胨大豆肉汤（Tryptic Soy Agar with Yeast Extract Broth，TSB-YE） 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；氯化钠、乙醇 国药集团化学试剂有限公司；木片、304不锈钢片、铝片、玻璃片、聚丙烯片、ABS片、亚克力片 尺寸均为1.4 cm×1.2 cm×0.1 cm，定制购于淘宝。

JJ500型电子天平 江苏常熟市双杰测试仪器厂；SW-CJ-1FD型无菌操作台 江苏苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-SⅡ型高压灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HWS-150型恒温恒湿培养箱 上海比朗仪器有限公司恒温恒湿培养箱；THZ-103B型恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司；XW-80A旋涡混合仪 上海精科实业有限公司；WAECO-CF50型松下冰箱 美国电子（深圳）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化及菌悬液制备 本研究所用的单核细胞增生李斯特菌实验菌株保存于-80±0.5 ℃的甘油管中，于实验前48 h在TSB-YE培养基进行平板划线，并置于4.0±0.5 ℃备用。实验前，用无菌接种环从TSA-YE培养基上挑取一单菌落，接种于TSBYE培养基，放置于37 ℃、110 r/min的摇床上培养16～18 h至稳定期。使用无菌生理盐水稀释，获得初始浓度为104～105CFU/mL的菌悬液。

1.2.2 接触表面无菌处理 将304不锈钢片、铝片和玻璃片浸泡于丙酮中3 h，并用厨房餐纸逐一擦拭干净，去除表面的油脂以及其他杂质。随后用无水乙醇溶液浸泡过夜，蒸馏水洗涤干净密封备用。实验前放入高压灭菌锅121 ℃，灭菌15 min。

将木片、聚丙烯片、ABS片及亚克力片用无菌水洗涤干净后，用无水乙醇浸泡3 h，随后放置于超净工作台内紫外线照射30 min，以达到无菌效果。

1.2.3 种群存活情况测定 用无菌镊子将灭菌后的材质放置于24孔板中，吸取0.1 mL上述备用菌悬液涂抹于材质表面，置于超净工作台中静置2 h后（记为零时刻），分别放置于25±0.5、4±0.5 ℃培养箱中进行培养，未接菌材质作为对照组。根据预试验，为满足模型参数估计的准确性，依次按0、2、4、10、22、46 h时刻点取样，开展平板计数实验。

当到达取样时间点时，用无菌镊子将材质从24孔板中取出，置于含有玻璃珠与无菌生理盐水的离心管中，充分振荡涡旋1 min，使菌体脱落并悬浮于生理盐水中。随后进行梯度稀释，选取合适梯度进行平板计数，菌量结果以lg CFU/cm2为单位比较。每组实验3次平行，重复3次。

1.2.4 存活动力学模型构建 预实验结果发现，不同材质表面单核细胞增生李斯特菌的群体密度下降曲线接近线性，因此选取Bigelow模型对其存活过程进行描述[19]。

式中：y（t）是t时刻（h）菌量，lg CFU/cm2；y0是初始菌量，lg CFU/cm2；D即D值，是将微生物杀灭90%所需时间，h。

1.2.5 统计分析与模型评价 应用Prism软件（版本8.0.2，GraphPad Software，加拿大）进行单因素方差分析（One-way ANOVA），用于比较在0.05显著性水平下不同温度或材质条件对单核细胞增生李斯特菌的存活能力差异。同时，应用Prism软件拟合不同处理条件下单核细胞增生李斯特菌的存活曲线，通过计算观测值和拟合值的均方根误差[20]（Root Mean Square Error，RMSE）和决定系数（Coefficient of Determination，R2）进行模型评价。

2 结果与分析

2.1 典型食品接触表面单核细胞增生李斯特菌的种群存活情况

本研究对接种于不同材质表面2 d内的单核细胞增生李斯特菌种群密度进行了测定，通过计算最后可计数时间点与初始时间点菌量的差值，量化存活情况。其中，未接种对照组无单核细胞增生李斯特菌检出。图1展示了单核细胞增生李斯特菌在不同温度和材质表面组合条件下持留一定时间后的活菌数减少量，活菌数减少量越少，表明该条件下单核细胞增生李斯特菌的存活能力越强。需要说明的是，由于木材质的浸润性特征，其表面水分会迅速浸湿挥发，单核细胞增生李斯特菌在4和25 ℃条件下的木片表面均出现了快速失活现象，而在其他材质表面存活时间则较长，因此需将木片条件结果独立展示和分析。

从图1A可知，单增李斯特在木材质表面25 ℃条件下4 h减少量已近1 lg CFU/cm2，超过了同温度条件下玻璃片和聚丙烯片表面46 h的减少量，表明在本研究中木材质表面最不利于单增李斯特菌的存活。比较图1B中的材质发现，单核细胞增生李斯特菌在4 ℃条件下的塑料类材质（ABS、聚丙烯和亚克力）表面存活能力较强，且其在聚丙烯片表面的存活能力显著强于在铝片表面（P＜0.05）；在25 ℃条件下，玻璃表面上单核细胞增生李斯特菌的存活能力则显著强于金属（不锈钢和铝）和聚丙烯材质（P＜0.05）。然而，经过46 h后，两种温度条件下图1B中不同表面的单核细胞增生李斯特菌种群对数减少量均未超过2 lg CFU/cm2。

图1 单核细胞增生李斯特菌在木片（A）及其他材质（B）表面的存活情况Fig.1 Survival of L. monocytogenes on wood chips (A) and other surfaces (B)

总体比较发现，单核细胞增生李斯特菌在4 ℃下的整体存活表现接近或强于25 ℃条件，一定程度反映了其嗜冷特性。同时，推测冷藏条件材料表面水分损耗的减少，亦有助于降低单核细胞增生李斯特菌的损伤，从而延长了其存活期。进一步，为定量描述和比较不同温度和材质组合条件下单核细胞增生李斯特菌的存活能力，需对其存活过程开展动力学分析。

2.2 典型食品接触表面单核细胞增生李斯特菌的种群存活动力学分析

实验发现，部分材质表面的单核细胞增生李斯特菌的种群密度出现了上下波动现象，但整体仍呈现出线性下降的趋势（见图2～图3）。通过拟合4和25 ℃下单核细胞增生李斯特菌在不同材质表面的存活曲线，获得的参数估计和模型评价结果罗列于表1。D值越大，说明单核细胞增生李斯特菌失活1 lg CFU/cm2所需要的时间更长，即存活能力越强。

表1 单核细胞增生李斯特菌在典型食品接触表面的存活模型拟合结果Table 1 Fitting results of L. monocytogenes survival model on typical food contact surfaces

图2 4 ℃条件下单核细胞增生李斯特菌在木片（A）、不锈钢片（B）、铝片（C）、ABS片（D）、玻璃片（E）、聚丙烯片（F）和亚克力片（G）表面的存活曲线拟合Fig.2 Survival curve fitting of L. monocytogenes on wood chips （A）, stainless steel chips （B）, aluminum chips（C）, ABS chips （D）,glass chips （E）, polypropylene chips （F） and acrylic chips （G） at 4 ℃

图3 25 ℃条件下单核细胞增生李斯特菌在木片（A）、不锈钢片（B）、铝片（C）、ABS片（D）、玻璃片（E）、聚丙烯片（F）和亚克力片（G）表面的存活曲线拟合Fig.3 Survival curve fitting of L. monocytogenes on wood chips (A), stainless steel chips (B), aluminum chips (C), ABS chips (D),glass chips (E), polypropylene chips (F) and acrylic chips (G) at 25 ℃

结果表明，木材质表面单核细胞增生李斯特菌在4 ℃的单位减少量用时是25 ℃的8.75倍；4 ℃条件下，单核细胞增生李斯特菌在聚丙烯片表面的D值超过300 h，说明其可在冷藏环境相关食品接触表面存活数天甚至数周；25 ℃条件的玻璃表面，单核细胞增生李斯特菌的D值也达到了接近100 h，进一步提示该菌在污染玻璃材质的食品接触表面后，如玻璃容器等，其可能具有更高的机率长期持留或发生交叉污染。

结合图2、图3和表1可发现，虽然线性模型可一定程度上描述单核细胞增生李斯特菌种群密度在不同温度与材质组合条件下的整体下降趋势，但大部分拟合模型的R2均偏低，值得进一步探讨其可能原因。根据表1结果，Y0的标准误约为0.1 lg CFU/cm2，拟合结果的RMSE也在0.08～0.33 lg CFU/cm2区间，说明本研究平板计数实验误差和拟合误差在可接受的范围内[21-22]。一方面，从图2～图3可直观看出，部分观测点单核细胞增生李斯特菌种群数量结果的标准差较大，这可能与其在不同接触面存在生物膜的形成与释放过程相关[23]。另一方面，通过计算不同组合条件下D值参数估计的相对误差，即标准误与估计值的比值[24]。可发现D值参数估计的相对误差与R2呈现反比现象，即相对误差越高，拟合优度越差。换言之，单核细胞增生李斯特菌种群D值的变异性可能影响了模型的拟合优度。4 ℃条件下ABS片、聚丙烯片和亚克力片表面单核细胞增生李斯特菌的存活D值估计结果相对误差（约30%）较木片、玻璃和金属类材质更高，可推断单核细胞增生李斯特菌在冷藏条件塑料类材质表面群体存活的变异性相对更大。因此，在未来定量风险评估工作中，需要采用概率评估方法描述相关场景下单核细胞增生李斯特菌的行为特征与潜在危害。

3 讨论与结论

目前，针对不同材质与环境组合条件下食源性致病菌的生存过程，仍缺少全面的横向比较研究与因果解释说明。关于食源性致病菌在食品接触表面的生存预测建模研究，则主要集中于不锈钢材质表面的情况[25-27]。如前述，在外部因素中，环境温湿度、接触表面材质、营养状态等可能是影响食源性致病菌生存状态的关键因素。

例如，Matthew等[28]发现产气肠杆菌在7 ℃条件下的不锈钢、聚氯乙烯、陶瓷表面比在15 ℃条件下相同表面的存活时间更长，与本研究关于冷藏条件整体更利于单核细胞增生李斯特菌存活的结果相符。这也从侧面说明了冰箱、冰柜等冷藏设备，可能为食源性致病菌的长期存活提供了重要场所，并具备成为食源性致病菌交叉污染源头的条件。同时，在所有材质中，单核细胞增生李斯特菌在玻璃和塑料类材质表面表现出了较强的生存能力，这与Silva等[16]对单核细胞增生李斯特菌在不同材质表面黏附能力的比较研究结果相符。因此，玻璃和塑料作为食物承装容器、食品包装和家用冰箱的典型材料，其表面的微生物安全性值得未来深入关注。

对于不同材质影响单核细胞增生李斯特菌生存能力的根本原因和机制，目前尚未有完备的理论体系可清晰阐释，但可能与材质的亲疏水性、浸润性、粗糙度等材料理化特征相关[29-31]。Allan等[17]研究了沙门菌属、小肠结肠炎耶尔森菌在不锈钢、树脂、塑料表面的存活过程，发现细菌更易在疏水性材料表面黏附和长期存活。如本研究中使用的木材质是一种多孔且亲水性较强的材料，观测到其明显不利于单核细胞增生李斯特菌的存活。相对于木材质，单核细胞增生李斯特菌菌悬液则可在疏水性相对较高的玻璃、塑料和金属类材质表面形成较小直径的液滴，且水分蒸发速率较慢，在一定时期内为菌体创造了相对湿润的环境，促进了种群的长期存活[25]。因此，可认为本研究中单核细胞增生李斯特菌在7种材质表面的存活表现差异也与材质表面的理化特性相关。

虽然本研究未对不同营养条件下单核细胞增生李斯特菌的生存能力进行比较，但Takahashi等[32]指出单核细胞增生李斯特菌更易存活于有鱼肉和猪肉基质的不锈钢表面，且整体生存能力显著强于鼠伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌。在食品的加工、供应及消费等环节，可能存在食物残留情况，在此条件下单核细胞增生李斯特菌可获得更多营养物质，其种群存活能力较本研究的寡营养条件下可能更强。因此，真实食品基质对致病菌的存活影响仍待探究，在未来研究中应继续建立不同营养条件下单核细胞增生李斯特菌在食品接触表面的生存动力学模型。

此外，黏附在食品接触表面的单核细胞增生李斯特菌还能进一步形成生物膜（Biofilm），成为可抵御苛刻环境条件的持续污染源[33-34]。同时，单核细胞增生李斯特菌通过交叉污染，在不同生态位间的动态传递，可能在更适宜生存的食品接触表面黏附定殖[35]。因此，应在考量温度、营养和表面材质等组合环境条件的基础上，进一步对食品接触表面和食品接触表面间转移的单核细胞增生李斯特菌开展定量观测，综合探究其在食品链中的生存行为规律。

综上，本文观测和定量分析了单核细胞增生李斯特菌在4和25 ℃条件下7种典型食品接触材质表面的存活过程。比较发现，单核细胞增生李斯特菌在冷藏环境下的不锈钢、木、铝、聚丙烯、亚克力材质表面的存活能力较室温环境下显著增强，可能在聚丙烯塑料表面持留数周。综合两种温度条件实验和建模结果，单核细胞增生李斯特菌在玻璃和聚丙烯表面的存活能力较强，应重点关注相关材质食品接触表面的微生物安全问题。同时，本研究所建立的线性模型可用于描述单核细胞增生李斯特菌种群在不同材质表面的存活趋势，但仍需在未来研究和实际应用中考虑微生物的生物膜形成过程和种群变异性对预测结果造成的影响。