周新宇，吕重宁，秦汝兰,

（1.通化师范学院医药学院，吉林通化 134000；2.沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳 110016）

刺玫果（Rosa davuricaPall.）为蔷薇科蔷薇属植物刺玫的成熟果实，又名蔷薇果、山刺玫果、野刺玫果等。野生资源丰富，主要分布于我国东北、内蒙、山西及河北等省区。刺玫果中含有黄酮、维生素、皂苷、多糖、三萜类等多种活性物质，其中研究较多的为黄酮类化合物[1]，但关于刺玫果中花色苷的研究报道较少。刺玫果果实酸甜可口，营养丰富。据《中国中药大辞典》中记载，刺玫果可用于治疗胃腹胀痛、小儿积食、咳嗽、腹泻及维生素C缺乏症等疾病，并具有明显的抗疲劳、耐缺氧、抗炎及增强免疫等活性[2-3]。目前，以野生刺玫果为主要原料的食品、保健品和功能性饮料不断出现[4]。

花色苷（anthocyanins）是具有2-苯基苯并毗喃结构的一类糖苷衍生物，其共轭双键在465～560 nm处有最大光吸收，为植物界中广泛分布的一种水溶性色素，普遍存在于植物的花、果实、根、茎、叶中，具有抗氧化、保护心血管、抗肿瘤等多种功能[5-6]。近年来对于花色苷抗氧化作用的研究较多，如吴映梅等[7]通过体外抗氧化实验得出黑莓中的总花色苷对DPPH自由基和羟自由基具有较强的清除作用。闫亚美等[8]研究发现质量浓度为0.1 mg·mL-1黑加仑花色苷提取液较同质量浓度的抗坏血酸，表现出更强的还原能力和自由基清除能力。何传波等[9]研究紫薯中花色苷抗氧化活性得出总抗氧化能力为101.38 U·mg-1，表明其花色苷抗氧化活性较强。综合文献分析，进一步揭示花色苷为最直接有效、安全的自由基清除剂[10]。此外，随着研究水平的不断提高，人们逐渐发现合成色素对人体健康存在一定的危害，因而从天然植物中寻找花色苷作为食品着色剂引起了人们的广泛关注[11]。

本研究以花色苷得率为评价指标，采用Plackett-Burman设计并结合Box-Behnken实验确定刺玫果中花色苷的最佳提取工艺，通过多种体外抗氧化方法评价刺玫果中花色苷的抗氧化活性，为刺玫果资源的开发及后续产品的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺玫果样品 采于通化师范学院周边经通化师范学院于俊林教授鉴定为刺玫果（Rosa davuricaPall.）正品，烘干粉碎后备用；无水乙醇、丙酮、甲醇、盐酸等试剂 均为国产分析纯；DPPH（1，1－二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐 阿拉丁试剂，上海有限公司。

KQ-250E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；YP2002电子天平 上海衡际科学仪器有限公司；TGL-16B台式离心机 上海安亭科学仪器厂；PB-10酸度计 北京赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 刺玫果中花色苷的提取工艺 刺玫果→粉碎至粗粉→按考察的实验条件进行超声提取→12000 r·min-1离心→上清液→用提取溶液补足或浓缩至25 mL→刺玫果花色苷提取物

1.2.2 最大吸收波长的确定 称取刺玫果粉末1 g，按1:15 g·mL-1的料液比加15 mL盐酸酸化的60%乙醇溶液（pH2），温度50 ℃，超声提取30 min，2次，12000 r·min-1离心，上清液定容于25 mL容量瓶中，于200～700 nm处进行全波长扫描，测定刺玫果中花色苷的最大吸收波长[12]。

1.2.3 提取溶剂的选择 称取刺玫果粉末1 g，4份，按1:15 g·mL-1的料液比分别加入15 mL盐酸酸化的蒸馏水、盐酸酸化的甲醇溶液、盐酸酸化的60%乙醇溶液、盐酸酸化的丙酮溶液，各溶液pH均为2，温度为50 ℃，超声提取30 min，2次，离心，上清液定容于25 mL容量瓶中，并于532 nm处测定各样品溶液的吸光度值，确定最佳提取溶剂，每组实验平行3次。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 料液比考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，料液比分别按照1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g·mL-1，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次。

1.2.4.2 溶剂pH考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，溶剂pH分别为1、2、3、4、5，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次。

1.2.4.3 超声温度考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，超声温度分别为20、30、40、50、60 ℃，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次。

1.2.4.4 乙醇体积分数考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，乙醇体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次。

1.2.4.5 超声时间考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，超声时间分别为10、20、30、40、50 min，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次。

1.2.4.6 超声次数考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，超声次数分别为1、2、3、4、5，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次。

1.2.5 Plackett-Burman试验设计 通过Plackett-Burman试验对可能影响刺玫果花色苷的6个因素，包括溶剂pH、超声时间、乙醇体积分数、超声温度、料液比、超声次数进行主效应分析，选用n=12的Plackett-Burman因素筛选试验，6个因素分别对应表中的6个列，每个因素取低水平“-1”和高水平“1”，以样品溶液的吸光度值A为响应值对实验结果进行分析，得出各因素的F值和P值，选取影响结果的关键因素，Plackett-Burman实验因素水平表和编码见表1。

表1 Plackett-Burman实验因素水平和编码Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental

1.2.6 Box-Behnken实验设计 在Plackett-Burman实验基础上，选取超声时间（A）、乙醇体积分数（B）、超声温度（C）、料液比（D）四个因素，以刺玫果花色苷吸光度值（Y）为响应值，通过四因素三水平实验进行响应面分析，实验设计因素水平见表2。

表2 Box-Behnken实验因素与水平设计Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.7 验证性实验 为确定响应面回归模型的建立的准确性，对模型预测的最优工艺条件进行适当调整后进行验证，实验平行操作3次。通过pH示差法[13-14]，按照下列公式计算刺玫果中花色苷含量。

式中：X为刺玫果花色苷含量（mg·g-1）；ΔT为吸光度ApH1和ApH4.5的差值；V为稀释体积（L）；F为稀释倍数；M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量（449 g·mol-1）；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数[26900 L·（mol·cm）-1]；m为样品质量（g）；b为比色皿厚度（1 cm）。

1.2.8 刺玫果中花色苷体外抗氧化活性研究

1.2.8.1 待测溶液的配制 按“1.2.7”项下最佳工艺条件提取刺玫果花色苷，减压浓缩至稠膏状，临用前稀释制成所需质量浓度。

1.2.8.2 刺玫果中花色苷对DPPH·清除率测定 精确称取15.7685 mg的DPPH粉末，置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.4 mmol·L-1的DPPH溶液，避光保存。按照“1.2.8.1”项下方法，制成1、2、3、4、5 mg·mL-1浓度供试品溶液。试验分为样品组、对照组和空白组，并于517 nm波长处测定各组吸光度值，其中空白组和样品组加入DPPH乙醇溶液后需避光静置1 h，其它操作相同。以VC溶液作为参照，按下列公式计算刺玫果中花色苷对DPPH·清除率[15-16]。

式中：A空白为2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL蒸馏水的吸光度值；A对照为2 mL蒸馏水+2 mL样品溶液的吸光度值；A样品为2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL样品溶液的吸光度值。

1.2.8.4 刺玫果中花色苷对ABTS+·的清除能力的测定 分别取7 mmol·L-1ABTS水溶液和2.5 mmol·L-1过硫酸钾水溶液5 mL，混匀，置于暗处反应12～16 h，使其产生ABTS+·，用蒸馏水将ABTS+·溶液稀释，使其在734 nm波长下的吸光值为0.70±0.02，得到工作液。按照“1.2.8.1”项下方法，制备2、4、6、8、10 mg·mL-1浓度供试品溶液。吸取1 mL系列浓度刺玫果花色苷溶液置于具塞试管中，分别加2 mL ABTS+·溶液，混合均匀，10 min后测定734 nm处的吸光值记作A1；吸取2 mL ABTS+·溶液与1 mL蒸馏水，混合10 min后测定734 nm处的吸光值记作A0；吸取2 mL磷酸盐缓冲液与1 mL系列浓度刺玫果花色苷溶液，混合10 min后测定734 nm处的吸光值记作A2。以VC作为阳性对照，操作方法同上。按下列公式计算刺玫果中花色苷对ABTS+·清除率[19]。

1.3数据处理

采用SPSS19.0统计软件进行单因素试验中Duncan’s多重差异显著性分析并计算样品对各自由基清除能力为50%时的IC50。实验数据图采用Excel 2010进行绘制。

2 结果与分析

2.1 刺玫果中花色苷最大吸收波长的确定

由图1可知，刺玫果花色苷提取液在532 nm处具有吸收峰。因此确定刺玫果花色苷最大吸收波长为532 nm。

图1 刺玫果花色苷在200～700 nm波长下的吸光度值Fig.1 Absorbance of anthocyanins of Rosa davurica Pall. at 200～700 nm

2.2 提取溶剂的确定

由于花色苷是极性分子，因此常用乙醇、甲醇或丙酮做为提取溶剂[20]，Bridgers等以甲醇、乙醇、酸化甲醇和酸化乙醇从紫红薯中提取花色苷时发现，酸化甲醇的提取效果最好[12]。Awika等用丙酮和酸化甲醇提取黑高粱花色苷时发现酸化甲醇的提取效果优于丙酮，经过液相分析得出丙酮提取的花色苷分子结构被修饰[21]。由图2可知，4种提取溶剂从刺玫果中提取花色苷后测定的吸光度值基本与文献得出的结论一致，分别为甲醇＞乙醇＞水＞丙酮，尽管很多报道表明甲醇的提取效果最好，但甲醇具有一定的毒性，因此选择乙醇为提取溶剂。并且花色苷在中性或碱性条件下不稳定，通常采用酸化的有机溶剂进行提取。

图2 提取溶剂对花色苷提取效果的影响Fig.2 Effects of extraction solution on anthocyanins extraction

2.3 单因素实验结果

2.3.1 料液比对刺玫果花色苷提取效果分析 由图3可知，随着料液比的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值呈现递增的趋势，当料液比超过1:15时，刺玫果花色苷的提取量呈现递减趋势。一定质量的刺玫果中花色苷提取率是有限的，溶剂体积的增大利于有效成分的溶出，当提取剂用量继续增加时，反而花色苷得率略有降低，表明花色苷已基本从组织中充分溶出，且提取剂过剩，不但会影响超声效果，而且可能会导致花色苷的水解，适当的料液比不仅有利于花色苷的溶出，而且也减少了料溶剂过多造成的试剂浪费[22]，故选择料液比为1:15进行提取。

图3 料液比对花色苷提取效果的影响Fig.3 Effects of solid/liquid ratio on anthocyanins extraction

2.3.2 溶剂pH对刺玫果花色苷提取效果分析 图4可知，随着pH的升高，刺玫果中花色苷的吸光度值呈现先升高后降低的趋势，当pH为2时，刺玫果中花色苷的吸光度值最高。分析其原因可能为花色苷属于水溶性多酚类化合物，可溶于水、乙醇等极性溶剂中，且在酸性条件下结构稳定[23]，故本实验在提取刺玫果中花色苷时，加入HCl试剂，以保证花色苷的结构稳定，防止其降解。文献研究表明[15]，花色苷在pH≤3的介质中呈现稳定的红色，随着pH增大，红色减弱，花色苷的结构转变为查耳酮类，稳定性降低。所以试验选用pH为2溶液从刺玫果中提取花色苷。

图4 pH对花色苷提取效果的影响Fig.4 Effects of pH on anthocyanins extraction

2.3.3 超声温度对刺玫果花色苷提取效果分析 由图5可知，随着超声温度的升高，刺玫果中花色苷的吸光度值逐渐增大，当超声温度为50 ℃时，刺玫果中花苷的吸光度值最大，温度继续上升，刺玫果中花苷的吸光度值反而降低，这可能是由于温度对细胞内花色苷的渗透、扩散和溶解有一定的影响。在低温时，花色苷溶解度较低，分子不易渗透。随温度升高，加速分子运动，使其溶解度增大，加快分子从细胞层之间的转移，有助于花色苷的提取，但花色苷耐热性较差，在高温环境和超声波的空化作用下，花色苷类物质会发生结构改变[24]，导致提取量降低，吸光度值减小。因此，实验从刺玫果中超声提取花色苷时温度确定为50 ℃。

图5 超声温度对花色苷提取效果的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on anthocyanins extraction

2.3.4 不同体积分数乙醇溶液对刺玫果花色苷提取效果分析 通过图6得出，随着乙醇体积分数的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值逐渐增大，当乙醇浓度为60%时吸光度值最高。花色苷是由苷元和糖基组成的，当乙醇体积分数过高时会导致花色苷中糖苷的溶解度降低，使得花色苷提取率随之减少[25]，故实验乙醇体积分数确定为60%。

图6 不同乙醇体积分数对花色苷提取效果的影响Fig.6 Effects of ethanol concentration on anthocyanins extraction

2.3.5 超声时间对刺玫果花色苷提取效果分析 从图7可知，随着超声时间的延长，刺玫果中花色苷的吸光度值呈现急剧上升趋势，当超声时间为30 min时，刺玫果中花色苷的吸光度值最高，之后基本呈现平稳状态，这是因为花色苷在固液之间基本达到了平衡[26]。因此，实验确定超声提取时间为30 min。

图7 超声时间对花色苷提取效果的影响Fig.7 Effects of ultrasound time on anthocyanins extraction

2.3.6 超声次数对刺玫果花色苷提取效果分析 图8所示，当超声提取为2次时，刺玫果中花色苷的吸光度值最大，随着超声次数增加，吸光度值基本保持不变，说明提取2次可以把花色苷全部提取出来，为提高实验效率，故本实验从刺玫果中提取花色苷超声次数确定为2次。

图8 超声次数对花色苷提取效果的影响Fig.8 Effects of ultrasound times on anthocyanins extraction

2.4 Placket-Burman试验结果分析

通过Design-Expert8.0.6软件对表3中的实验数据进行多元回归分析，经影响因素筛选，得到以吸光度值为响应值的线性回归方程Y=0.36+0.014X1+0.041X2+0.084X3+0.050X4+0.041X5+0.019X6，模 型P=0.0010（P＜0.01），具有统计学意义，说明该模型在研究区域拟合性良好，所得回归方程显著[27]。一般情况下决定系数R2越高，说明实验的可信度和精确度越高，实验得到的R2=97.21%，表明回归模型与数据吻合较好。各因素效应评价结果见表4，从表4中的主效应分析可知，Placket-Burman试验在二水平范围内，超声时间（X2）、乙醇体积分数（X3）、超声温度（X4）、料液比（X5）影响显著（P＜0.05），影响响应值的因素顺序依次为乙醇体积分数（P=0.0002）＞超声温度（P=0.0023）＞超声时间（P=0.0053）=料液比（P=0.0053）＞超声次数（X6）（P=0.0826）＞溶剂pH（X1）（P=0.1709），由此推断，乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间为影响刺玫果花色苷提取条件的关键因素。

表3 Plackett-Burman试验设计及响应值Table 3 Experimental design and response values of Plackett-Burman

表4 Plackett-Burman试验设计各因素效应评价Table 4 Effect evaluations of each factor under Plackett-Burman test design

2.5 Box-Benhnken试验结果分析

2.5.1 数学模型的建立与显著性实验 在Placket-Burman试验基础上，采用Design-Expert8.0.6软件对表5中的实验数据进行多项拟合回归，得到刺玫果中花色苷吸光度值对超声时间（A）、乙醇体积分数（B）、超声温度（C）及料液比（D）4个影响因素的二次多项回归方程：Y=+0.48-0.014A+0.018B+0.028C+0.029D+0.038AB-2.500E-003AC+0.056AD-0.081BC+1.250E-003BD+0.028CD-0.18A2-0.070B2-0.098C2-0.091D2。

表5 Box-Benhnken试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

回归方程方差显著性分析结果见表6，由表6实验数据可知，模型的F=45.40，P＜0.0001，表明实验所用的二次模型是极显著的，具有统计学意义。失拟项P=0.1610（＞0.05），表明此响应面模型对试验拟合的情况较好，误差较小[28]；模型拟合的多元决定系数R2=0.9784，表明模型拟合度良好，调整性决定系数R2Adj=0.9569，表明该模型能解释95.69%响应值的变化，则用该模型能代替真实试验点对超声法提取刺玫果中花色苷提取量的分析和预测。从表6各因素的P值可知，回归模型中的B、C、D、AB、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2具有显著性（P＜0.05），而A、AC、BD均不显著（P＞0.05），表明各因素对刺玫果中花色苷提取量的影响不同，调整不同因素将达到不同提取效果。

表6 Box-Benhnken回归模型方差分析结果Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

2.5.2 各因素间相互作用响应面分析结果 三维曲面反映每两个影响因素之间的交互作用，曲面越较陡，说明各因素对响应值的影响较为显著，拟合的响应曲面能直观反映各因素之间的交互作用[29]。图9所示为当料液比、超声温度、乙醇体积分数、超声时间中任意两因素固定为0水平时，直观地反映其余两个因素交互作用对花色苷吸光度值的影响。图9中各图可以看出三维曲面较陡，响应值波动较大，表明料液比与超声温度，料液比与超声时间，超声温度与乙醇体积分数，乙醇体积分数与超声时间的之间的交互作用对刺玫果中花色苷吸光度值影响较大，实验结果与方差分析一致。

图9 各因素间相互作用的响应曲面图Fig.9 Response surface diagram of interaction of various factors

2.6 最优工艺条件确定与验证性实验

通过Design-Expert.8.06软件对回归方程进行计算，得到刺玫果花色苷最佳提取工艺条件为：料液比为1:15.9 g·mL-1，超声温度为51.49 ℃，乙醇体积分数为60.88%，超声时间为29.94 min，刺玫果花色苷最大吸光度预测值为0.487，结合实际操作，将提取工艺合理化后，改为：料液比1:15 g·mL-1，超声温度50 ℃，乙醇体积分数60%，超声时间30 min，提取次数2次，溶液pH为2。在此条件下进行3次验证性试验，测定平均吸光度值为0.481±0.019，与预测值接近，说明该工艺准确可行。通过pH示差法计算得出，在最佳工艺条件下，刺玫果中花色苷的提取量为185.033 mg·100g-1。

2.7 刺玫果中花色苷体外抗氧化活性分析

2.7.1 刺玫果中花色苷对DPPH·清除能力 DPPH·有单电子，在517 nm波长处，其醇溶液呈紫色。自由基清除剂能使单电子配对，从而使吸光度值降低，颜色褪去，且成定量关系[30]。花色苷分子结构上有多个酚羟基，可以通过自身氧化释放电子，进而清除DPPH等自由基[31]。实验以抗坏血酸（VC）为阳性对照，研究刺玫果中花色苷物质对DPPH·清除能力，由图10可知，刺玫果中花色苷物质和抗坏血酸均具有一定的DPPH·清除能力，但弱于同浓度的VC。刺玫果中花色苷对DPPH·的清除能力在考察浓度1～5 mg·mL-1范围内，抗氧化能力随样品溶液浓度的升高逐渐增强，当样品溶液浓度为5 mg·mL-1，清除率为81.11%。通过SPSS软件计算得出VC和刺玫果花色苷对DPPH·清除能力的IC50值分别为0.270和2.299 mg·mL-1，结果进一步表明刺玫果中花色苷对DPPH·具有一定的清除能力。

图10 DPPH自由基清除率的测定Fig.10 Determination of DPPH free radical scavenging rates

2.7.2 刺玫果中花色苷对超氧阴离子自由基清除能力 超氧阴离子自由基是机体内寿命最长的自由基，在一定条件下可生成羟自由基、过氧化氢、脂质过氧化物及单线态氧等其他活性氧，从而造成机体的氧化损伤[32]。如图11所示，刺玫果中花色苷物质和抗坏血酸均具有一定的超氧阴离子自由基清除能力，且强于同浓度的VC。刺玫果花色苷提取物在实验浓度范围内，对超氧阴离子自由基的抑制作用随质量浓度增加而增强，经SPSS软件计算得刺玫果花色苷提取物和VC溶液的IC50值分别为1.902和2.607 mg·mL-1。由此可见，刺玫果花色苷提取物对超氧阴离子具有较强抗氧化能力。

图11 超氧阴离子自由基清除率的测定Fig.11 Determination of O2－free radical scavenging rates

2.7.3 刺玫果中花色苷对ABTS+·的清除能力ABTS在K2S2O8作用下可被氧化成绿色的ABTS+·，在抗氧化物存在时，ABTS+·与之反应变成没有颜色的的ABTS，因此ABTS法可用于检测样品的抗氧化能力[33]。图12表明，刺玫果花色苷提取物和VC均具有一定的清除ABTS+·能力，刺玫果花色苷清除ABTS+·能力弱于同浓度时的VC溶液。刺玫果花色苷提取物和VC的IC50值分别为8.993和1.314 mg·mL-1。因此表明，刺玫果花色苷提取物对ABTS+·具有极好的清除能力。

图12 ABTS+自由基清除率的测定Fig.12 Determination of ABTS+ free radical scavenging rates

3 结论

本文通过单因素实验及Placket-Burman设计对影响刺玫果花色苷提取的因素进行筛选，并结合Box-Benhnken实验设计及响应面分析法对参数进行优化，确定刺玫果中花色苷最佳提取条件为：采用HCl调节溶液pH为2的60%乙醇作为提取溶剂，料液比1:15 g·mL-1，超声温度为50 ℃，超声时间30 min，提取2次，在此工艺条件下得出刺玫果中花色苷得率为185.033 mg·100g-1。实验条件稳定，操作简单，可作为从刺玫果中提取花色苷的工艺方法。此外，体外抗氧化能力研究结果表明，刺玫果中花色苷对DPPH·、超氧阴离子自由基、ABTS+·均表现出较强的清除能力，IC50值均小于10 mg·mL-1，提示刺玫果中花色苷物质具有一定的抗氧化能力。实验结果为刺玫果资源的开发利用及后续抗氧化产品的研发提供了一定的参考依据。