殷晓伟 杨玉柱 贾贺 徐雪房 黄政 许艳梅

胸水脱落细胞学鉴别恶性间皮瘤(Malignant mesothelioma， MM)与反应性间皮细胞增生(Reactive mesothelial hyperplasia， RMH)的难点在于形态上瘤细胞存在重叠，而侵犯邻近组织等组织学特点在细胞学标本中无法观察，此时增加细胞块切片辅助免疫细胞化学染色可有效提高MM的诊断准确率，所以寻找一组可靠的免疫标记物尤为重要。随着细胞DNA-ICM技术被广泛应用，使肿瘤的研究提高到了定量分析水平[1]，近年来，因其特异性强且准确度高的优点，在宫颈癌及乳腺癌的临床诊断中具有较高的应用价值[2-4]。已有学者提出DNA-ICM技术在恶性胸水的诊断中有较高的灵敏度[5]，可能为良恶性浆膜腔积液的鉴别提供一种新的诊断思路。本文分别探讨免疫细胞化学技术及细胞DNA-ICM技术的诊断价值，进一步分析联合应用对浆膜腔积液内MM的诊断价值。

资料与方法

一、研究对象

收集山东省单县中心医院2014年1月—2019年12月间经组织学证实的胸水病例共50例，其中MM 30例，男性12例，女性18例，年龄39～74例(中位年龄62岁)；RMH 20例，男性13例，女性7例，年龄45～77岁(中位年龄65岁)。所有病例均有组织病理证实诊断准确。

二、研究方法

将新鲜胸水制备细胞涂片两张，一张室温下瑞氏-吉姆萨染色在光学显微镜下分析，一张行改良Feulgen DNA染色，用于DNA定量扫描分析，其余标本离心后经全自动脱水机处理后，石蜡包埋制成做细胞块用于免疫细胞化学检测。

三、判定标准

免疫细胞化学联合检测判定标准：EZH2、GLUT-1任意一项检测阳性即为阳性。

DNA倍体分析结果判定标准：系统将扫描细胞自动分类并计数，同时通过测定细胞核的积分光密度来判断DNA的相对含量，DNA含量的大小描述为 DNA 指数( DNA index，DI)，正常细胞DI值为1，当DI>2. 5为异倍体细胞，且异常细胞数≥3个为阳性，DI≤2.5者为阴性[6]。

四、统计学方法

用SPSS 25.0统计软件进行统计分析，计数资料以例数、百分比表示，比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、免疫细胞化学检测EZH2、GLUT-1在胸腔积液中的表达情况

EZH2阳性定位于细胞核，在30例MM中(见图1A)阳性表达率为83%，20例RMH中(见图1B)阳性表达率为25%，EZH2在MM与RMH中的表达差异有统计学意义(P<0.05)。GLUT-1阳性定位于细胞膜，在30例MM中(见图2A)阳性表达率为70%，20例RMH中(见图2B)无阳性表达，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

图1 EZH2的表达情况 SP×200

图2 GLUT-1的表达情况 SP×200

表1 免疫细胞化学检测EZH2、GLUT-1在胸腔积液中的表达情况

二、EZH2和GLUT-1联合检测在胸水MM中的诊断价值

EZH2、GLUT-1对MM诊断的灵敏度分别为80%、70%，特异度分别为73%、72%，当EZH2、GLUT-1联合检测时，对MM诊断的灵敏度为93%，差异有统计学意义(P<0.05)，特异度为86%，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 联合检测 EZH2、GLUT-1对胸腔积液内MM诊断的灵敏度和特异度

三、DNA定量分析结果

50例样本，经活检组织证实其中MM 30例，DNA扫描诊断27例，RMH 20例，经DNA扫描诊断16例，DNA倍体分析符合率和阳性检出率分别为86%(43/50)、90%(27/30)(见图3，4)。

图3 一例恶性间皮瘤胸水标本DNA定量分析检测

四、各种检查方法灵敏度及特异度的比较

免疫细胞化学技术检测EZH2及GLUT-1在MM诊断的灵敏度、特异度分别为93%，86%，DNA定量分析的灵敏度及特异度分别为90%、80%，联合应用免疫细胞化学技术及DNA定量分析敏感度为97%，特异度为75%(见表3)。

表3 各种检查方法灵敏度及特异度[n(%)]

讨 论

浆膜腔积液是MM常见的首发症状，并且样本的获取相对安全，操作简单易行，因此细胞学检查对于MM的诊断具有无法取代的优势。当病变的间皮性质明确时，MM与RMH的鉴别是病理医师需要面临的重大挑战，虽然RMH是良性病变，但有时与MM的细胞学特征重叠，仅涂片和常规染色难以鉴别诊断[7-8]，因此寻找一种有效的生物标记物尤为重要。本课题前期实验结果提示EZH2及GLUT-1抗体组合在组织病理中是区分MM与RMH的有效生物标志物[9]，故推测在浆膜腔积液细胞学诊断中亦具有一定的价值。

图4 一例反应性间皮细胞增生性胸水标本DNA定量分析检测

Zeste 基因增强子人类同源物2(Enhancer of zeste homolog ，EZH2)是人PcG基因家族中多梳抑制复合物2(PRC2)的核心组成成份，是近年在表观遗传领域发现的一种具有组蛋白甲基转移酶活性的肿瘤相关蛋白，具有靶向催化组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)甲基化的作用，参与细胞的周期调控、衰老和细胞分化并可沉默细胞分化相关基因参与肿瘤的发生[10-13]。早期研究表明，EZH2在MM组织中的表达明显高于RMH，而EZH2的敲除，则抑制MM发生，Jiang等[14]研究浆膜腔积液中EZH2的表达情况，结果显示恶性积液中阳性表达率为90%，而RMH为16%。 在我们的研究中 EZH2在30例MM中阳性表达率为83%，20例RMH中阳性表达率为25%，结果与Jiang等人的研究相符。葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter protein 1，GLUT-1)是目前已知分布最为广泛的葡萄糖转运蛋白，主要介导细胞内外的跨膜转运，对糖代谢的调节等功能起到关键作用[15]，与肿瘤的发生和发展密切相关，已有报道在多种上皮源性恶性肿瘤中均有 GLUT-1的过表达[16-17]。浆膜腔积液中的肿瘤细胞因无法依靠血管生成获取氧及营养物质，此时肿瘤细胞在低氧状态下主要通过糖酵解获能，葡萄糖的摄取及代谢均处于增高状态，细胞对其所处微环境的反应导致GLUT-1过表达。有研究[18]提出GLUT-1在胸水良恶性病变的鉴别上具有重要的应用价值。以往研究的关注点大部分集中在转移性腺癌与RMH的鉴别，而针对MM与RMH的研究较少，本研究在病变明确为间皮来源的基础上，利用免疫细胞化学技术检测30例MM中GLUT-1阳性表达率为70%，而在20例RMH中均未见表达，由此可见，GLUT-1是一种在浆膜腔积液内鉴别良恶性间皮病变的重要肿瘤标志物。在最近的两项间皮病变研究中，EZH2对MM诊断的敏感度为45%～66%，联合BAP1和EZH2可将敏感度增加到74%～90%[8]。本实验中，联合EZH2和GLUT-1的敏感性为93%，大大提高了MM诊断的可靠性。

DNA是细胞生长、繁殖的基础，正常人体细胞为二倍体，生理状态下DNA结构及含量发生周期性变化[1]。当细胞恶变时，基因突变可导致染色体数目发生改变，从而形成非整倍体细胞。DNA含量的改变能较客观地反应细胞的增生状态，因此，若出现 DNA 含量异常增高或是处于增殖期的细胞数目异常增多，均可提示机体组织有恶性病变的可能[19]。目前，就DNA-ICM的临床应用已经达成了国际共识。也有越来越多的临床数据证实了DNA-ICM作为一种辅助方法适用于宫颈上皮内病变和浸润癌的诊断和预后。同时有研究提出，DNA-ICM在判断浆膜腔积液的良恶性质方面，具有一定临床价值[20-22]。本实验在经活检组织证实的 30例MM及20例RMH的浆膜腔积液内检测了细胞的DNA含量，经DNA扫描诊断符合率和阳性检出率分别为86%(43/50)、90%(27/30)，均提示其在浆膜腔积液内良恶性间皮病变的鉴别中，有较高的使用价值。

虽然细胞块联合免疫细胞化学技术在浆膜腔积液的诊断中有肯定的临床价值，但由于敏感性不高而出现一部分假阴性。而细胞 DNA 定量分析法可快速识别标本中少数癌变细胞，其诊断结果较常规方法更客观。本研究运用脱落细胞学DNA定量分析检测MM的灵敏度为90%，与免疫细胞化学技术相比无统计学意义(P>0.05)，但若两者联合使用则有较好的互补性，其敏感度达97%。可显著提高浆膜腔积液内良恶性间皮病变鉴别诊断的准确性，具有很高的应用价值。