李金敏，高绪娜，桑瑞新，宫本芝，徐海燕，谷 巍，郝木强，兰江华，王 红

(1.山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东省动物微生态制剂重点实验室，泰安 271000；2.济宁市农业科学研究院，济宁 272031)

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)是一种肠外致病性大肠杆菌，可引起禽类大肠杆菌病，并常与其他呼吸道疾病混合感染，引发禽类腹膜炎、肝周炎、心包炎等病变，严重的可引发败血症，导致禽类死亡[1-2]。此外，禽大肠杆菌病不仅会降低禽类生产性能，提高死亡率，与其他疾病混合感染还会加重病情，降低疫苗免疫效力[3]。

目前国内外防治禽大肠杆菌病的主要手段仍为抗生素，但抗生素的长期使用所引发的药物残留等食品安全问题及产生耐药菌等问题已引起了广泛关注[4-5]。因此，亟需开发安全、高效的禽大肠杆菌病防治手段。鉴于该病的自然感染途径主要通过呼吸系统及消化系统两方面单独或协同诱发，从调控养殖环境中致病性大肠杆菌的数量入手，对于防控该病的发病率具有重要的生物安全意义。

噬菌体作为一种专一侵袭目标细菌的病毒，具有繁殖迅速、特异性强的优势，能快速裂解目标菌株，从而达到杀菌的目的。自被发现至今一百多年的时间里，研究者一直尝试着将其作为新型抗菌剂应用于病原菌的防控，且有些已在国外获批上市[6]。大量研究表明，噬菌体对人及动物是安全的[7-9]，噬菌体作为一种可替代抗生素的生物制剂及环境改良剂，具有广阔的应用前景。

本研究以O2血清型禽大肠杆菌为研究对象，从养殖环境中分离相应的噬菌体，并对噬菌体的生物学特性及环境杀菌效果进行综合评估，以期为噬菌体制剂的推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 宿主菌O2血清型禽大肠杆菌CVCC1552购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心。

1.1.2 主要试剂及仪器 胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Tris-HCl缓冲溶液购自北京索莱宝科技有限公司；PEG8000购自长春天佳生物技术有限公司；氯仿购自重庆川东化工有限公司；DNase Ⅰ、RNase A、微量病毒提取试剂盒、限制性核酸内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ均购自宝生物工程(大连)有限公司；0.22 μm微孔滤膜购自PALL公司。 超净工作台、电热恒温培养箱、恒温振荡培养箱等均购自山东博科科学仪器有限公司；Philips Tecnai 10透射式电镜购自Philips公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体的分离纯化 于山东省泰安市某鸭场粪池采集粪便样品。将采集到的样品加入15 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，4 ℃静置过夜。将样品于12 000 r/min离心10～15 min去除大部分固体杂质，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。取10 mL过滤液加入10 mL已灭菌TSB培养基中，再按照1%接种量加入对数生长期的宿主菌种子液，37 ℃、180 r/min振荡培养过夜，次日将培养液8 000 r/min离心15 min,取1 mL上清液加入10 mL TSB培养基，并按照1%接种量接种对数生长期的宿主菌种子液，室温静置1 h后于37 ℃振荡培养4 h，培养结束后8 000 r/min离心15 min，过滤，即得噬菌体原液。

用50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液对噬菌体原液进行梯度稀释，取合适梯度噬菌体稀释液0.3 mL与0.3 mL宿主菌种子液混合，加入5 mL 约55 ℃ TSB半固体培养基，混匀后倒入TSA平板上，平板凝固后倒置于37 ℃培养箱4～6 h，观察噬菌斑生长情况。挑取直径大且透亮的噬菌斑于Tris-HCl缓冲溶液，适当稀释后按照前述分离方法进行纯化，重复3～5次，直至噬菌斑形状大小均匀。挑取单个噬菌斑至10 mL TSB培养基，并按照1%接种量接种对数生长期的宿主菌液，37 ℃、180 r/min振荡培养过夜；离心过滤后即得纯化的噬菌体裂解液，同时参照文献方法进行噬菌体滴度测定[10]。

1.2.2 噬菌体电镜观察 参照文献提供方法，采用PEG8000制备噬菌体颗粒浓缩液，取10 μL浓缩液滴于铜网上，自然沉淀10 min，用滤纸吸去侧面多余液体，加1滴磷钨酸至铜网上，染色10 min，铜网干燥后用透射电镜进行观察[11]。

1.2.3 基因组提取及核酸类型确定 利用PEG8000制备噬菌体颗粒浓缩液，在浓缩液中加入DNaseⅠ、RNase A，37 ℃孵育30 min，采用微量病毒提取试剂盒提取噬菌体核酸。用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ 对提取到的噬菌体核酸进行酶切，酶切产物用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据酶切图谱鉴定噬菌体核酸类型。

1.2.4 噬菌体生物学特性分析

1.2.4.1 噬菌谱测定 测定该噬菌体对本实验室保存的除宿主菌之外的其余10株大肠杆菌的宿主谱，10株大肠杆菌于37 ℃、180 r/min振荡培养过夜，噬菌体过滤液及大肠杆菌菌液各取100 μL，加入5 mL TSB半固体培养基，混匀后倒入TSA平板上，凝固后倒置于37 ℃培养箱4～6 h，观察有无噬菌斑生长。

1.2.4.2 最佳感染复数(MOI)测定 将宿主菌培养至对数生长期，并进行活菌计数。宿主菌按照培养基体积的1%加至灭菌的TSB液体培养基中，噬菌体裂解液按照感染复数为0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001加入，37 ℃、180 r/min振荡培养3.5 h，5 000 r/min离心15 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，梯度稀释法测定裂解液滴度，以产生最高滴度的感染复数组作为该噬菌体的最佳感染复数。

1.2.4.3 一步生长曲线 将噬菌体及对数生成长期的宿主菌按照最佳感染复数加至100 mL TSB液体培养基中，37 ℃振荡培养箱静置孵育15 min 后180 r/min振荡培养，每隔20 min 取样，测定噬菌体滴度。以时间为横坐标、噬菌体滴度为纵坐标绘制一步生长曲线图。 通过下列公式计算噬菌体裂解量。

裂解量=裂解末期噬菌体滴度/裂解初期宿主菌数

1.2.4.4 热稳定性测定 取1 mL 噬菌体纯培养液(109PFU/mL)置于无菌EP管内，分别于40、50、60、70、80 ℃水浴中孵育1 h 后，测定噬菌体滴度。以温度为横坐标、噬菌体滴度为纵坐标绘制温度耐受性曲线图。

1.2.4.5 酸碱稳定性测定 取噬菌体纯培养液(109PFU/mL)按照1∶9的比例分别加至pH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的Tris-HCl缓冲溶液中，37 ℃水浴中孵育1 h 后，测定噬菌体滴度。以pH为横坐标、噬菌体滴度为纵坐标，绘制酸碱耐受性曲线图。

1.2.5 环境杀菌效果评估

1.2.5.1 液体杀菌效果评估 制备宿主菌菌悬液，离心、缓冲液重悬后获得去培养基菌悬液，将菌悬液活菌数调整到2.0×105CFU/mL，然后按体积比1∶1加入相应噬菌体(混匀后效价分别为在1.0×104、1.0×105、1.0×106PFU/mL左右)，对照组加入等量TSB培养基，25 ℃放置，分别在1和6 h取样，测定宿主菌活菌数。

1.2.5.2 载体(鸡粪)杀菌效果评估 制备宿主菌菌悬液，稀释菌液浓度到4.0×106CFU/mL，分别以体积比1∶1加入浓度为4.0×105、4.0×106、4.0×107PFU/mL的噬菌体，混匀后取1 mL混合液滴加于已高压灭菌并烘干的10 g鸡粪中，搅拌均匀(使得鸡粪含宿主菌为2.0×105CFU/g；鸡粪含噬菌体分别为2.0×104、2.0×105和2.0×106PFU/g)，以加等量TSB培养基为空白对照组，用玻璃纸密封，于25 ℃培养箱放置，分别在5和10 h 取样，测定宿主菌活菌数。

1.2.6 统计分析 试验数据用Excel 2010进行初步处理后，采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并进行LSD多重比较。结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 噬菌体的分离纯化

通过双层平板法分离纯化出1株禽大肠杆菌(O2血清型)噬菌体，命名为ФECP2-1。该噬菌体在双层平板上形成直径1 mm 左右圆形透明噬菌斑，有较大晕圈(图1)。

图1 噬菌体ФECP2-1噬菌斑

2.2 噬菌体电镜观察结果

在透射电子显微镜下观察发现，该噬菌体具有正多面体的头部和细而长的尾部结构，头部直径约98 nm，尾部长约123 nm(图2)，初步判定为肌尾科噬菌体。

图2 噬菌体ФECP2-1电镜图片(400 000×)

2.3 基因组提取及核酸类型确定

由图3可知，噬菌体ФECP2-1可被限制性内切酶切开，表明噬菌体ФECP2-1为双链DNA噬菌体。根据酶切结果预测其基因组大小约为29 kb。

1，噬菌体DNA；M1，15 kb DNA Marker；2，EcoRⅠ酶切；3，Hind Ⅲ 酶切；M2，10 kb DNA Marker

2.4 噬菌体生物学特性测定结果

2.4.1 噬菌谱测定结果 对除宿主菌之外其余10株大肠杆菌进行宿主谱测定，发现噬菌体ФECP2-1还能裂解C8-0008、C8-0020、C8-0033、C8-0040、C8-0045、C8-0047、C8-0106、CVCC1568 8株宿主菌(含与宿主菌不同血清型菌株)(表1)，表明该噬菌体还可裂解自身血清型之外的其他大肠杆菌，具有较宽的裂解谱。

表1 噬菌体ФECP2-1宿主谱

2.4.2 最佳感染复数测定结果 噬菌体ФECP2-1在感染复数为0.00001时所产生的的子代噬菌体滴度最高，为1.66×1010PFU/mL(图4)，表明噬菌体ФECP2-1最佳感染复数为0.00001。

图4 噬菌体ФECP2-1最佳感染复数

2.4.3 一步生长曲线测定结果 通过一步生长曲线测定发现，噬菌体ФECP2-1感染宿主菌的潜伏期为20～40 min，裂解时间为80～100 min，120 min后进入平台期，噬菌体最高滴度为6.20×1010PFU/mL(图5)，通过裂解量公式得出该噬菌体裂解量为4 133 PFU/cell。

图5 噬菌体ФECP2-1一步生长曲线

2.4.4 热稳定性测定结果 由热稳定性曲线图可知，噬菌体ФECP2-1在40～50 ℃滴度变化不明显，60 ℃处理1 h，噬菌体滴度降低接近50%，60 ℃以上噬菌体滴度骤降，至80 ℃时基本降至0(图6)。

图6 噬菌体ФECP2-1热稳定性

2.4.5 酸碱稳定性测定结果 噬菌体ФECP2-1在 pH 3.0～11.0范围内较稳定。强酸、强碱都会造成噬菌体活性降低。在经pH为1.0及12.0缓冲液处理后，噬菌体ФECP2-1完全失活(图7)。

图7 噬菌体ФECP2-1酸碱稳定性

2.5 噬菌体ФECP2-1环境杀菌效果评估

2.5.1 液体杀菌效果评估 由表2可知，在液体条件下，浓度为1.0×104～1.0×106PFU/mL的噬菌体ФECP2-1 对浓度1.0×105CFU/mL的宿主菌杀菌率均在99.9%以上，且杀菌率随着噬菌体浓度的增加而显著增加(P<0.05),随作用时间的延长杀菌率略有增加。说明该噬菌体在液体中具有较好的杀菌效果，可用于养殖环境中液体的消毒。

表2 噬菌体ФECP2-1对液体杀菌效果

2.5.2 载体(鸡粪)杀菌效果评估结果 由表3可知，浓度为2.0×104～2.0×106PFU/g 的噬菌体ФECP2-1 对鸡粪中浓度为2.0×105CFU/g的宿主菌均具有杀菌效果，杀菌率均在99.0%以上。杀菌率随着噬菌体浓度的增加显著增加(P<0.05)，随作用时间的延长杀菌率略有增加。说明该噬菌体针对鸡粪中的宿主菌也具有一定的杀菌效果。

表3 噬菌体ФECP2-1鸡粪杀菌效果

3 讨 论

目前养殖业中关于禽大肠杆菌病的防控手段仍主要采用抗生素疗法，但大肠杆菌极易对抗生素产生耐药性，进而增强该菌的致病力，给养禽业带来更大的经济损失[12]。针对细菌耐药性问题，相关部门也出台了一系列限抗禁抗政策，在这种情况下，寻求新的防控手段成为一种必然。噬菌体以其独特的生物学特性及在防控细菌性疾病方面的巨大优势及潜力而备受关注[13]。

本研究以禽大肠杆菌CVCC1552为宿主菌，从山东泰安某养鸭场粪污样品中分离得到1株具有较宽裂解谱的禽大肠杆菌噬菌体，将其命名为ФECP2-1。该噬菌体在双层平板上形成的噬菌斑清晰、透亮，且在噬菌斑周围形成较大的环形晕圈。晕圈的形成被认为是由噬菌体产生的一种具有多糖降解能力的解聚酶降解噬菌斑周边宿主菌多糖骨架而成。此外，晕圈的形成也被认为是噬菌体具有荚膜水解酶活性的指示器。以上结果说明该噬菌体不仅可裂解宿主菌，还可降解细菌生物膜，具有较强的杀菌能力[14]。

通过透射电镜观察噬菌体ФECP2-1具有正多面体的头部和细而长的尾部结构，同时结合酶切鉴定结果，确定该噬菌体为双链DNA、肌尾科噬菌体，这与现有文献[15-16]中报道的大肠杆菌噬菌体结构特征基本一致。

根据噬菌体裂解谱的宽窄可将噬菌体分为宽谱噬菌体和专一性噬菌体。自然界中大部分噬菌体专一性较强，只能特异性裂解某一细菌的某一血清型，但为了应对当前养殖行业中出现的病原菌混合感染，筛选宽谱噬菌体具有重要应用价值[17]。噬菌体ФECP2-1可裂解多种来源且不同血清型的大肠杆菌，裂解谱宽于吴圆圆等[18]报道的鸡大肠杆菌噬菌体的裂解谱，说明该噬菌体可与多种细菌表面受体相结合进而裂解细菌，具有较高的应用价值。

噬菌体ФECP2-1最佳感染复数为0.00001，表明噬菌体对宿主菌CVCC1552极度易感。 潜伏期为20～40 min，对宿主菌的裂解量为4 133 PFU/cell，远高于魏炳栋等[19]报道的大肠杆菌噬菌体裂解量370 PFU/cell。说明该噬菌体具有较强的裂解能力，适于投入生产使用，提高噬菌体的生产效率。

温度和pH的变化对噬菌体滴度也具有不同程度的影响。 噬菌体ФECP2-1的温度及pH稳定性结果显示，在60 ℃及以下温度条件下噬菌体滴度相对稳定，高于此温度则滴度骤降。 这一结果与杨慧敏等[20]报道的鸡大肠杆菌噬菌体在60 ℃作用20 min噬菌体全部失活不同。 说明本研究分离到的禽大肠杆菌噬菌体温度耐受性更强，这一性能更有利于噬菌体制剂的商品化。噬菌体ФECP2-1在pH 3.0～11.0范围内滴度较稳定，这一结果也优于文献报道的同类噬菌体的酸碱耐受范围[21-22]。说明该噬菌体在不同的酸碱环境中均具有裂解细菌的能力，这一特性对于噬菌体作为环境消毒剂进行开发具有重要意义。

O2血清型大肠杆菌是禽类常见的致病力较强且发病率较高的大肠杆菌血清型之一，可引起禽类的胸膜炎及败血症[23]。在实际生产中由于杂菌干扰、噬菌体施用及取样不均匀等因素的存在，以致于无法对某一特异性噬菌体的真实杀菌效果进行评估。本研究排除以上干扰因素的影响，较理想化的使用噬菌体ФECP2-1针对处理过的养殖水体及鸡粪中宿主菌进行防控，以最大程度的呈现噬菌体的真实杀菌效果。结果显示噬菌体干预组液体及粪便大肠杆菌活菌数较初始均有明显降低，杀菌率均在99%以上。其中噬菌体ФECP2-1针对液体中大肠杆菌杀菌效果优于对鸡粪中大肠杆菌杀菌效果，这可能与2种基质中噬菌体与宿主菌的接触概率有一定关系，此外鸡粪中有机质对于噬菌体的杀菌效果也可能存在一定干扰。噬菌体ФECP2-1对鸡粪中大肠杆菌杀菌效果仍略优于文献中报道的杀菌效果[24]。 综上可知，噬菌体ФECP2-1对于实验室模拟的养殖环境感染的大肠杆菌具有良好的防控效果。

4 结 论

本研究从养殖环境中分离筛选到1株禽大肠杆菌O2血清型强裂解性噬菌体ФECP2-1，属于肌尾科噬菌体，具有较宽的裂解谱及良好的热稳定性、pH耐受性。该噬菌体感染复数低、裂解量高，在模拟养殖环境中表现出较好的杀菌效果，是一株具有较好应用前景的噬菌体。本研究为噬菌体类生物消毒剂的研发奠定了基础，为禽大肠杆菌病的防控提供了新的思路。