宋姗姗，杨 洋，陈 阳，何 静

(西安医学院第一附属医院妇产科，陕西 西安 710077)

子痫前期(preeclampsia，PE)为妊娠期相关疾病，常因造成不良孕产结局而导致围生期母婴死亡[1]。疾病多发于妊娠20周之后，患者出现血压升高、蛋白尿、水肿等，如病情加重会出现全身抽搐及多脏器功能损伤[2]。研究显示，子痫前期与早产、胎死宫内、胎儿窘迫、胎儿宫内生长受限及胎盘早剥等不良孕产结局均直接相关[3]。PE患者一旦发生不良孕产结局，会对患者产生巨大影响并增加社会经济负担，故该疾病不良孕产结局的预测对于临床具有重要价值。

目前研究显示，PE相关微小RNA以及相关血管生成因子在PE的预测中具有一定作用[4]。其中微小RNA152(microRNA-152，miR-152)[5]、胎盘生长因子(placental growth factor，PIGF)、可溶性血管内皮生长因子(soluble fms-like tyrosine kinase 1，sFlt-1)和可溶性内皮抑素(soluble endoglin，sEng)水平对PE的发生具有重要预测及诊断价值[6]。但是，在PE患者群体中，上述因子是否与PE发生所导致的孕产不良结局具有相关性仍值得探索。因此，通过本研究项目，选择既往研究发现对PE发病有诊断价值的因子miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng作为候选因子，筛选特异性和敏感性较高的组合对PE患者发生不良孕产结局进行诊断预测，期待能够为PE的临床诊治提供理论依据。

1对象与方法

1.1研究对象

选取西安医学院第一附属医院产科2019年1月至2020年12月收治的145例子痫前期患者为研究对象。纳入标准：①诊断符合子痫前期，诊断标准参照第九版人民卫生出版社《妇产科学》；②自然妊娠；③单胎妊娠；④既往无高血压或者子痫病史。其中，发生不良孕产结局者为研究组(n=60)，未发生不良孕产结局者为对照组(n=85)。不良孕产结局包括早产、胎盘早剥、胎儿窘迫、低出生体重儿、胎死宫内、新生儿肺炎。本研究经医院伦理委员会同意并批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2研究方法

所有患者诊断PE，入院后清晨空腹采集静脉血8mL，3 000r/min离心5分钟后，吸取上层血清，标记后置于-80℃冰箱保存待检测。

1.2.1 miR-152的检测

采用实时定量PCR分析法检测各组miR-152的表达。按照RNAisoTM试剂盒说明步骤提取血清总样本RNA，检测RNA质量。根据PrimerBank公布的基因序列设计合成miR-152及内参U6的引物序列。miR-152上游引物序列：GTCGTCAGTGC ATGACAGAACTT；miR-152下游引物序列：GTG CAGGGTCCGAGGT。U6上游引物序列：CTC GCTTCGGCAGCACA；U6下游引物序列：AAC GCTTCACGAATTTGCGT。使用PrimeScript RT Master Mix反转录合成miR-152 cDNA。以U6为内参，按照SYBR Premix ExTaq试剂盒说明行实时定量PCR反应。每次检测设定3个复孔，每个样本重复3次。以上在每个PCR循环的延伸期采集荧光信号，PCR反应完成后利用温度梯度变性获得溶解曲线供PCR产物定性分析。根据PCR扩增曲线，得到每个样本的循环周期数(Cq值)，计算各组中目的基因的表达水平情况。

1.2.2产妇血清sFlt-1、PIGF、sEng的检测

采用酶联免疫吸附试验法检测各组产妇血清中sFlt-1、PIGF、sEng的表达水平。操作步骤严格按照试剂盒要求进行，所有标本重复检测3次，以变异量低于5%时记录检测结果为最终浓度。

1.3统计学方法

2结果

2.1各组患者临床特征比较

本研究145例PE患者中发生不良孕产结局的患者为60例(41.38%)，其中早产40例(66.67%)、胎盘早剥5例(8.33%)、胎儿窘迫12例(20.00%)、低出生体重儿44例(73.33%)、胎死宫内1例(1.67%)、新生儿肺炎13例(21.67%)。研究组患者孕周和胎儿出生体重小于对照组，差异有统计学意义(t/H值分别为7.58、11.29，P<0.05)，两组间年龄和住院天数差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组一般资料分析Table 1 General data analysis between the two

2.2各组患者miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng的表达比较

与对照组相比，研究组患者miR-152、sFlt-1、sEng的表达水平上升，PIGF水平下降，差异均具有统计学意义(t/H值分别为-7.73、-3.62、-5.18、4.06，P<0.05)，见表2。

表2 两组miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng的表达分析Table 2 Expression analysis of miR-152,PIGF,sFlt-1 and sEng between the two

2.3患者miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng对不良孕产结局的诊断预测

单独指标诊断PE患者发生不良孕产结局时，miR-152诊断AUC最大，为0.80；sFlt-1诊断特异性较高，为96.47%；而sEng诊断敏感性较高，为88.33%。联合指标诊断时，AUC为0.89，特异性为86.23%，敏感性为77.47%，见表3及图1。

表3 miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng对不良孕产结局的诊断预测分析Table 3 The diagnostic prediction of miR-152,PIGF,sFlt-1 and sEng on adverse pregnancy outcomes

3讨论

3.1针对PE患者不良孕产结局的诊断预测意义

PE可导致严重母儿并发症及不良妊娠结局，其为胎盘源性疾病，胎盘娩出后症状即消退；但在PE患者人群中胎盘功能出现异常变化的程度常常不一，并不是所有的患者均会出现相同或类似的围产结局，尤其是严重的围产结局患者；另外，在临床工作中，PE患者的发病因素、临床表现、首发病征均存在个体差异[7]，因此在PE的产时管理(包括分娩时机和方式的选择)中面临着很大的挑战和考验。如何及时识别PE患者中不良孕产结局的发生风险、提早预判和积极处置，以得到最佳的围产结局具有非常重要的临床意义[8]。因此，本研究选择miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng水平作为候选预测因子，进行ROC曲线分析，筛选特异性和敏感性较高的组合预测模型，探究不同因子单独或联合诊断预测已确诊为PE的患者发生不良孕产结局的诊断价值。

3.2外周血miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng对PE患者不良孕产结局的诊断预测分析

既往研究发现，miRNA调控了PE患者病理生理变化。在分子生物学和遗传学水平，微小RNA通过与其靶基因相互作用，参与PE的发病过程[9]。其中，子痫前期相关miR-152可通过调控人组织相容性白细胞抗原G的表达参与子痫前期发生，其通过提高自然杀伤细胞对滋养细胞的杀伤作用参与PE发病过程[10]。且既往研究发现，通过检测孕妇血清中miR-152的表达联合超声指标对PE的发病具有较高的诊断预测价值[5]。本研究在PE患者中利用miR-152对其不良孕产结局进行ROC分析，同样发现miR-152诊断预测价值较好，其AUC面积为0.80，特异性为76%，敏感性为78%，提示miR-152不仅可以作为PE疾病发生的预测因子，同时在PE不良孕产结局的预测中具有重要临床应用价值。

另外，PE的发病机制主要和胎盘形成、植入过程中促血管和抗血管生成因子的不平衡进一步导致内皮功能紊乱有关，故血管生成相关因子与PE的发生密切相关[11-12]。其中，PIGF为促血管生成因子代表，sFlt-1和sEng为抗血管生成因子代表。已有大量研究结果表明，在PE患者的血清中，sFlt-1及sEng水平呈明显增高趋势，而PIGF呈明显下降趋势，该变化可能引起血管收缩以及内皮细胞的损伤，从而导致如胎儿宫内生长受限等不良孕产结局[11-13]。本研究发现，和对照组相比，研究组患者PIGF的表达水平显著下降，miR-152、sFlt-1和sEng的表达水平显著上升，提示以上指标和疾病的预后同样密切相关。既往研究认为，对于PE孕妇，孕早期和孕中期sFlt-1和sEng水平的连续性变化可预测PE患者是否发生早产，提示上述指标对PE患者发生不良孕产结局同样具有预测价值[14]。本研究通过ROC曲线进一步发现sFlt-1、PIGF的诊断特异性较高，而sEng诊断敏感性较高。相关机制研究认为，在PE发生前5～6周sFlt-1和PIGF水平即增加，而sEng水平则在发生PE前2～3个月即开始增高[11]。故相对于sFlt-1和PIGF，sEng水平具有更高的敏感性，而当疾病进展后，sFlt-1和PIGF水平的增加显示出其诊断预测不良孕产结局的高度特异性。

3.3外周血miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng联合检测可提高对PE患者不良孕产结局的诊断预测效率

以往研究结果证实，对PIGF、sFlt-1和sEng水平的联合检测，可以显著增加孕妇PE的检出率[15]。本研究在miR-152因子的基础上，结合以上血管形成相关因子建立联合诊断模型，提示对上述因子联合诊断预测PE患者发生不良孕产结局时，AUC为0.89，特异性为86.23%，敏感性为77.47%。故对于已确诊的PE患者，预测其是否发生不良孕产结局时，若为了进一步提高诊断预测率，可选择上述多因子联合检测行诊断预测。另外，上述因子在孕早期或孕中期是否仍具有诊断预测应用价值，在后续的研究中，我们将进一步探究。

综上，外周血中miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng水平不仅可用于预测PE疾病，而且也可作为预测已确诊的PE患者发生不良孕产结局的指标，其中单独应用miR-152具有良好的诊断效果，多因子联合检测诊断效率更高。通过本项目研究，以期能够为PE疾病的临床诊断预测提供参考依据。