葛 飞，孟凡亮

（安徽医科大学附属巢湖医院呼吸内科，安徽 合肥 238000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种与老龄化和吸烟相关的气流不可逆受限为特征的疾病，到2030年，慢性阻塞性肺疾病将成为全球第3 大死因，目前发展中国家患病率仍在上升[1]。近年来，由于其高死亡率和致命的共病[2]，引起了越来越多的关注，且慢性阻塞性肺病在老年人中诊断过度，在成人中诊断不足，因此需要寻找一种有效诊断慢性阻塞性肺疾病的方法。微小核糖核酸（miRNAs）是一个不断增长的小非编码核糖核酸家族，通过与靶向信使核糖核酸（mRNAs）的3 非翻译区（3UTR）结合来调节基因表达[3]。通过改变miRNAs 的表达来调节细胞活动[4]，如增殖、凋亡、分化，其与肾脏疾病、心血管功能障碍、肺部疾病和癌症等多种疾病的发生有关[5-8]。慢性阻塞性肺疾病与有毒气体或香烟烟雾的慢性炎性反应增强有关[9]，降钙素原（PCT）、C 反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）可准确反映慢阻肺患者体内炎症反应的严重程度，是了解患者病情变化的主要实验室指标[10]。因此，本研究分析了三组miR-146a/b 相对表达量的差异，及其与上述指标的相关性，评价其临床价值与意义，旨在为该病的诊断提供参考，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1 月-11 月安徽医科大学附属巢湖医院急性加重期慢阻肺（AECOPD）患者90例，稳定期慢阻肺（stable COPD）患者90例。另选取在安徽医科大学附属巢湖医院进行健康体检，且年龄、性别与全部慢阻肺患者相匹配的健康体检者90例设为对照组。按照2020年慢性阻塞性肺疾病GOLD 指南，把急性加重期组分为GOLD2 级6例，GOLD3 级69例，GOLD4 级15例；稳定期组分为GOLD2 级21例，GOLD3 级66例，GOLD4 级3例。急性加重期组男64例，女26例；年龄（74.87±8.09）岁；BMI（23.36±3.04）kg/m2。稳定期组男67例，女23例；年龄（75.40±8.16）岁；BMI（22.46±2.97）kg/m2。对照组男65例，女25例；年龄（74.06±7.82）岁；BMI（23.05±2.93）kg/m2。三组年龄、性别及BMI 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究获得安徽医科大学附属巢湖医院伦理委员会的批准，研究对象知情同意并签署同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 急性加重期组 纳入标准：①年龄＞50岁；②根据全球慢性阻塞性肺疾病倡议标准诊断为慢性阻塞性肺疾病；③至少连续2 d 出现至少2 种以下主要症状（呼吸困难增加、痰脓增加、痰量增加）或1 种主要和1 种次要症状（流涕/充血、喘息、喉咙痛、咳嗽）的急性加重。排除标准：并发哮喘、肺癌或其他相关肺部疾病；严重感染、肿瘤、自身免疫性疾病的病史。

1.2.2 稳定期组 纳入标准：①年龄＞50岁；②根据金标准诊断为慢性阻塞性肺病；③在过去的6个月无急性恶化。排除标准与急性加重期组相同。

1.2.3 对照组 排除患有感染、肺病、肾功能或肝功能障碍以及严重感染、恶性肿瘤、自身免疫性疾病史。

1.3 标本采集 慢阻肺急性加重期患者入院第1 天、稳定期慢阻肺患者和健康者体检采集外周血。室温静置1 h 后，外周血在4 ℃下以3000 r/min 条件下离心15 min，获得上清液，装于的EP 管中，置于-80 ℃冰箱保存，集中进行检测。

1.4 miR-146a/b 的检测方法

1.4.1 miRNA 的提取 采用北京天根生化科技有限公司miRcute 血清/血浆miRNA 提取分离试剂盒DP503 提取研究对象的血清标本总miRNA，将获得的miRNA 溶液置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 RNA 逆转录合成cDNA 采用上海吉玛制药技术有限公司逆转录聚合酶链反应定量试剂盒逆转录为cDNA。

1.4.3 实时定量PCR 法 采用上海吉玛制药技术有限公司逆转录聚合酶链反应定量试剂盒，荧光定量PCR（Q-PCR）实验染料法。miR-146a、miR-146b 以U6 为标准化内参。采用2-△△Ct 算法计算miR-146a、miR-146b 相对表达量。其中△△Ct=（Ct 实验组目的基因-Ct 实验组U6）-（Ct 对照组目的基因-Ct 对照组U6），qRT-PCR 引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.5 血清炎症标志物和肺功能指标的检测方法

1.5.1 血清炎症标志物（PCT、CRP 及ESR）表达水平的检测方法 研究对象均在清晨空腹状态下抽取静脉血液5 ml，采用免疫散射速率比浊法测定超敏C反应蛋白（hs-CRP）表达水平；采用酶联免疫吸附法测定PCT；采用魏氏法测定ESR 表达水平。

1.5.2 肺功能指标的检测方法 所有研究对象均通过肺功能检测仪检测其肺功能包括1 秒用力呼气量（FEV1）、1 秒用力呼气量/用力肺活量（FEV1/FVC）和最大呼气流量（PEF）。

1.6 统计学方法 采用统计学软件SPSS 22.0 进行数据分析，计数资料使用（n）表示，比较采用χ2检验；计量资料的数据以（）表示，比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，miR-146a/b 相对表达量与GOLD 分期比较运用Kruskal-Wallis H 检验，与炎症标志物和肺功能指标的相关关系使用Pearson 相关分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组肺功能指标比较 急性加重期组和稳定期组的FEV1、FEV1预测值、FEV1/FVC 均低于对照组，且稳定期组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三组肺功能指标比较（）

表2 三组肺功能指标比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与稳定期组比较，bP＜0.05

2.2 三组血清炎性标志物比较 急性加重期组血清PCT、CRP 及ESR 表达水平均高于稳定期组和对照组（P＜0.05）。稳定期组PCT、CRP 及ESR 表达水平均高于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 三组血清炎性标志物比较（）

表3 三组血清炎性标志物比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与稳定期组比较，bP＜0.05

2.3 三组miR-146a/b 比较 急性加重期组血清中的miR-146a 水平低于稳定期组和对照组（P＜0.05）；稳定期组和对照组血清中miR-146a 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；急性加重期组血清中的miR-146b 水平低于稳定期组和对照组（P＜0.05）；稳定期组和对照组血清中miR-146b 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 三组miR-146a/b 比较（）

表4 三组miR-146a/b 比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05，cP＞0.05；与稳定期组比较，bP＜0.05

2.4 miR-146a/b 相对表达量与GOLD 分期的关系急性加重期组各GOLD 分期miR-146a/b 的表达量分布不全相同，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A、图1B；稳定期组中GOLD 分期miR-146a/b 的表达量分布不全相同，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1C、图1D。

图1 miR-146a/b 相对表达量与GOLD 分期的关系

2.5 miR-146a/b 的水平与血清炎性标志物和肺功能指标的相关性 急性加重期组和稳定期组血清中miR-146a/b 水平与PCT、CRP 及ESR 均呈负相关性关系，与FEV1、FEV1预测值、FEV1/FVC 均呈正相性关系，见表5、表6。

表5 急性加重期组miR-146a/b 表达量与各指标的相关性（r）

表6 稳定期组miR-146a/b 表达量与各指标的相关性（r）

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病是一个重大的全球性健康问题，与慢性气道和肺实质炎症有关[11]。20%的急性加重期慢性阻塞性肺疾病病例是由非感染因素引起的，而大多数慢性阻塞性肺疾病急性加重是由感染引起的。慢性阻塞性肺疾病患者的急性加重会增加气道炎症，增加炎症因子的合成，激活补体系统，并导致体内炎症增加，所以感染是导致慢性阻塞性肺疾病的最关键因素[10，12，13]。目前临床上以患者有慢性咳嗽、咳痰、进行性加重的呼吸困难及有慢性阻塞性肺疾病危险因素的接触史时，考虑慢性阻塞性肺疾病。肺功能检查能明确诊断气道的不可逆气流受限；但并没有新的、有效的生物标志物来诊断慢性阻塞性肺疾病。

MiR-146a 和miR-146b 属于miR-146 家族[8]。MicroRNAs（miRNAs）是一个19～24个核苷酸的非编码RNA 家族，其在转录后调节基因表达，具有重要的生物学功能[3，14]。慢性阻塞性肺疾病的加重可能会导致机体炎症反应的加剧，从而导致血液循环中感染指标的变化。ESR、CRP、PCT 是提示感染的实验室指标，可反映患者炎症反应的水平[3，14]。

本研究结果显示，急性加重期组血清炎性标志物和肺功能指标均高于稳定期组和对照组，说明急性加重期慢性阻塞性肺疾病比稳定期有更明显的炎症反应和肺功能下降。

近些年有研究表明[16-18]，miR-146a 下调白细胞介素1 受体（IL-1R）和Toll 样受体（TLR）信号成分IL-1 受体相关激酶（IRAK1）和肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF6），对IL-1β、IL-6 和IL-8 等炎症因子有着负反馈调节的能力。miR-146b-5p 在非小细胞肺癌（NSCLC）通过靶向IRAK1，抑制核因子κB（NF-κB）活性和NF-kB 相关IL-6、IL-8 的产生，且miR-146b-5p 与IRAK1 呈负相关；IRAK1 是IL-1R/TLR 信号通路中的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与NF-κB 调节的炎症反应、抗凋亡和肿瘤进展[19，20]，说明miR-146a/b 可能通过与靶mRNAs 的3UTR 相互作用来调节基因表达，导致翻译抑制或mRNA降解，或者两者兼有。另有研究证实，在未成熟树突状细胞（imdc）和成熟树突状细胞（mDCs）中过表达miR-146a 和/或miR-146b 则增加DC 凋亡，ImDC和MDCS 中miR-146a 和miR-146b 的表达与TRAF6 和IRAK1 的表达呈负相关。此外，TRAF6 和（或）IRAK1 的siRNA 沉默促进了DC 的凋亡。沉默miR-146a 和miR146b 可通过IL-12p70 介导的自然杀伤细胞活化增加IL-12p70、IL-6 和TNF-γ 的产生以及IFN-γ 的产生，而mDCs 中miR-146a 和miR-146b 的过表达则减少细胞因子的产生，在树突状细胞中miR-146a 和miR-146b 还可以下调NF-κB[3]。因此推测出一种负反馈机制，即miR-146a/b-TRAF6/IRAK1-NF-kB 轴调节人树突状细胞凋亡和细胞炎症因子的产生，进而调节炎症反应，说明miR-146a/b 是一种抗炎miRNA。本研究结果显示，在急性加重期组和稳定期组中miR-146a/b的相对表达量与血清炎性标志物呈负相关，与肺功能呈正相关；并且急性加重期组的miR-146a/b 的相对表达量低于稳定期组，进而推测出miR-146a/b在炎症激活的调节中都起着关键作用，在慢性阻塞性肺疾病中miR-146a/b 低表达减少对炎症反应的抑制，抗炎作用减弱，导致炎症因子的大量分泌，增加了炎症反应，进而破坏肺泡细胞使肺功能进一步下降，使病情更加恶化。因此，miR-146a/b 的相对表达量可能诊断出急性加重期慢性阻塞性肺疾病，而稳定期组与对照组的miR-146a/b 的相对表达量相似，所以不能通过miR-146a/b 来诊断稳定期的慢性阻塞性肺疾病。

综上所述，miR-146a/b 在急性加重期慢性阻塞性肺疾病患者的血清中低表达，与炎症反应水平呈负相关，与肺功能指标呈正相关，miR-146a/b 有望成为辅助急性加重期慢性阻塞性肺疾病早期诊断的重要生物分子标志物，对急性加重期慢性阻塞性肺疾病的早期诊断和预后具有重要价值。本研究尚存不足之处，包括样本量不足及尚未研究miR-146a/b 在肺组织中的表达情况等，仍需要深入研究。