邢津溥，赵 欣，梁佳文，苍 晶，张 达

(东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

低温严重限制植物的分布和产量。茉莉酸(jasmonic acid, JA)作为一种信号分子，正向调控多种植物的抗寒性。低温胁迫提高了水稻()和拟南芥()体内JA的含量，研究表明，这与JA生物合成基因的表达增加、JA分解代谢相关酶的基因表达受抑制有关。外源施加JA可显著提高拟南芥的组成型及冷驯化诱导的抗寒能力；相反，阻断植物内源JA的合成及信号转导，则导致植物对寒害敏感。

JA的生物合成受环境胁迫影响，JA生物合成相关基因如脂氧合酶(lipoxygenase)基因、丙二烯氧化物合酶(allene oxide synthase)基因、丙二烯环氧化酶(allene oxide cyclase)基因、12-氧代植二烯酸还原酶(12-oxophytodienoate reductase)基因的转录均受JA诱导。低温、高渗等胁迫也均能诱导JA的合成以及上述基因的表达。其中，LOX是含有非血红素铁的双加氧酶，广泛存在于植物中，在种子萌发、果实成熟、育性、衰老以及应对外界干旱、高渗、高温、低温、机械损伤、病原微生物侵染等胁迫中，均伴随基因的表达。此外，基因的表达也受到外源物质如几丁质、水杨酸、MeJA等诱导。小麦基因家族共鉴定到至少50 个成员，可分为9-和13-两个亚家族，是JA合成途径中的关键酶，主要催化JA前体生物合成的起始步骤。Menga等发现，硬粒小麦基因在遭受高渗胁迫下表达量明显上升；Venegas-Molina等发现，拟南芥、西兰花中基因在遭受虫害和干旱胁迫下表达量发生显著变化；Gao等发现，水稻中基因在细胞代谢、细胞死亡和疾病抵抗中发挥作用。拟南芥中LOX2-AOS-AOC复合物促进JA的生物合成，从而微调植物对生物和非生物刺激的反应。因此，研究JA合成相关基因及关键酶LOX2对解析JA对非生物胁迫的调控作用具有重要的意义。

东农冬麦1号(Dn1)是强抗寒性冬小麦品种，外源MeJA处理提高了Dn1在低温胁迫下的抗寒能力以及JA信号转导途径关键基因、的表达量；且JA参与了低温胁迫ICE-CBF途径，提高了冷响应基因、、和的表达量，从而提高了其抗寒性。但Dn1的强抗寒性是否与内源JA合成基因的表达有关，外源MeJA处理对Dn1抗寒性的提高是否与内源JA的合成有关，都尚不清楚。本研究拟探讨外源MeJA处理对低温胁迫下Dn1中几个JA生物合成基因(、、、、、、、和)表达量的影响，并结合生物信息学分析预测、和编码蛋白的功能，进一步揭示JA合成基因在冬小麦响应抗寒中的作用，以期为阐明植物激素JA调控冬小麦抗寒性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

强抗寒性冬小麦品种东农冬麦1号(Dn1)，在黑龙江地区返青率达85%，由东北农业大学小麦室提供。于2018年9月8日播种于东北农业大学试验田，行长2 m，行距0.25 m，10行区。每行播种量为150粒，播深5 cm，常规田间管理，于三叶期在叶面喷施1 mmol·L的MeJA，对照喷施等量水，分别用MeJA和CK表示。待大田自然降温，连续10 d最低温度平均为5 ℃(对照温度，2018年10月15日)、0 ℃(2018年11月 2日)、 -10 ℃(2018年11月24日)和 -25 ℃(2019年1月14日)时，选取长势一致的麦苗，剪取分蘖节和叶片，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA的提取及表达量分析

使用RNA提取试剂盒Ultrapure RNA Kit(康为世纪，江苏)提取冬小麦分蘖节和叶片的总RNA，使用反转录试剂盒(全式金，北京)进行cDNA第一条链的合成，反应体系为20 μL，包括1 μL RNA，1 μL Oligo(dT)，1 μL gRNA Remover，1 μL TranScript Enzyne Mix， 6 μL RNase-free Water，10 μL 2×Reaction Mix。反应程序：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。使用Primer Premier 5.0软件设计(GQ166692)、(GQ166691)、(HQ913602)、(KJ001800)、(KF039887)和(KM216389)的qRT-PCR特异性引物(此处的引物为靶向小麦基因5A、5B、5D亚基因组同源区的引物)，以小麦为内参基因。此外，以NCBI发布的小麦基因序列(GQ166691)在小麦多组学数据库进行BLAST，检索到小麦5A、5B、5D基因组上的三个拷贝：TraesCS5A02G378700(5A)、Traes CS5B02G382300(5B)和TraesCS5D 02G388700(5D)，用在线软件primer sever设计小麦、、的特异性引物，引物序列见表1。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书(诺唯赞，南京)反应体系进行表达量分析。反应程序： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s， 95 ℃ 15 s。用2-△△t方法 计算待测基因的相对表达量。3次生物学重复， 采用Prism 6.0软件进行数据统计和显著性 分析。

表1 本研究所用到的qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR used in the study

1.2.2、、的生物信息学分析

从小麦多组学数据库网站(http://202.194.139.32/#)对染色体位置进行确定，使用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org)在线程序分析、、基因编码蛋白的理化性质；采用ProtComp 9.0(http://www.softberry.com/)在线程序预测蛋白的亚细胞定位；应用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html和SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在线程序预测蛋白的二级和三级结构；利用MEGA 6软件N-J法对小麦()及其他7个物种的LOX2蛋白构建系统进化树并分析。利用MEME-Submission form(http://meme-suite.org/tools/meme)对上述物种LOX2蛋白的基序进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 外源MeJA处理对低温胁迫下Dn1分蘖节及叶片JA合成基因表达量的影响

2.1.1 JA合成基因、和表达量的变化

如表2所示，随着温度的降低，在分蘖节中，对照组和基因的相对表达量呈降-升-降的变化趋势，分别在 -10 ℃、5 ℃时达到最大值，而基因的相对表达量呈先升后降的变化趋势，在 -10 ℃时达到最大值；而处理组和基因的相对表达量呈升-降-升的变化趋势，均在0 ℃达到最大值，基因则呈现持续下降的变化趋势。在叶片中，对照组基因的相对表达量呈先降后升的变化趋势，在 -25 ℃时达到最大值，而、基因的相对表达量呈升-降-升的变化趋势，分别在0 ℃、 -25 ℃时达到最大值；处理组、基因呈先降后升的变化趋势，在 -25 ℃时达到最大值，而基因呈先升后降的变化趋势，在 -10 ℃时达到最大值。

表2 外源MeJA处理对JA合成基因 TaLOX1、 TaLOX2、 TaLOX3相对表达量的影响Table 2 Effect of MeJA treatment on the relative expression of JA synthesis genesTaLOX1, TaLOX2andTaLOX3

与对照组相比，外源MeJA处理提高了Dn1分蘖节在0 ℃下、和的相对表达量，降低了 -10 ℃下这三个基因的相对表达量，且、的降幅达极显著水平，的降幅达显著水平；外源MeJA处理显著降低了Dn1叶片在0 ℃和 -25 ℃下以及 0 ℃下的相对表达量，显著提高了 -10 ℃下的表相对达量。表明低温和MeJA处理提高了早期(0 ℃)Dn1的内源JA合成，启动了JA信号转导。

2.1.2、、表达量的 变化

如表3所示，随着温度的降低，在分蘖节中，对照组和基因的相对表达量呈降-升-降的变化趋势，分别在5 ℃和 -10 ℃时达到最大值，而基因的相对表达量则呈先升后降的变化趋势，在 -10 ℃时达到最大值；处理组、基因的相对表达量分别呈先降后升、持续下降的变化趋势，均在5 ℃时达到最大值，而基因的相对表达量呈升-降-升的变化趋势，在0 ℃时达到最大值。在叶片中，对照组、基因的相对表达量均呈先降后升的变化趋势，均在5 ℃时达到最大值，而基因呈先升后降的变化趋势，在 -10 ℃时达到最大值；处理组基因的相对表达量呈降-升-降的变化趋势，在 -10 ℃时达到最大值，而、基因的相对表达量呈先降后升的变化趋势，分别在 5 ℃和 -25 ℃时达到最大值。

表3 外源MeJA处理对JA合成基因TaAOS、TaAOC、 TaOPR2相对表达量的影响Table 3 Effect of MeJA treatment on the relative expression of JA synthesis genes TaAOS,TaAOC and TaOPR2

与对照组相比，外源MeJA处理提高了Dn1分蘖节在0 ℃下、、三个基因的相对表达量，且的增幅达极显著水平，的增幅达显著水平；降低了这三个基因在 -10 ℃下的相对表达量，其中、的降幅达极显著水平，的降幅达显著水平；且外源MeJA处理极显著提高了Dn1叶片 -10 ℃下和 -25 ℃下的相对表达量，显著提高了-25 ℃下叶片中的相对表达量，极显著降低了0 ℃、 -10 ℃和 -25 ℃下叶片中的相对表达量。

2.1.3、、表达量变化

如表4所示，随着温度的降低，在分蘖节中，对照组和基因的相对表达量呈先升后降的变化趋势，均在0 ℃时达到最大值，而基因的相对表达量呈降-升-降的变化趋势，在 -10 ℃时达到最大值；处理组和基因的相对表达量呈升-降-升的变化趋势，均在 -25 ℃时达到最大值，而基因的相对表达量呈先降后升的变化趋势，在 -25 ℃时达到最大值。在叶片中，对照组和处理组Dn1叶片中、和基因的相对表达量均呈持续上升趋势(除处理组0 ℃下和除外)，均在 -25 ℃时达到最大值。

表4 外源MeJA处理对TaLOX2A、TaLOX2B、TaLOX2D相对表达量的影响Table 4 Effect of MeJA treatment on the relative expression of TaLOX2A, TaLOX2Band TaLOX2D

与对照组相比，外源MeJA处理降低了Dn1分蘖节和叶片在0 ℃、 -10 ℃下、和的相对表达量，部分基因降幅达显著或极显著水平；外源MeJA处理提高了 -25 ℃下分蘖节中、和的相对表达量，且的降幅达极显著水平，的降幅达显著水平；外源MeJA处理极显著降低了-25 ℃下叶片中的相对表达量，极显著提高了 -25 ℃下叶片中和基因的相对表达量。

2.2 TaLOX2A、TaLOX2B、TaLOX2D的生物信息学分析

2.2.1 蛋白质理化性质分析

基因(TraesCS5A02G378700)位于基因组5A染色体575 705 509～575 709 396区间，基因全长为3 888 bp，编码864个氨基酸。蛋白相对分子量为96.8 kDa，理论等电点为 6.09，属于酸性蛋白；280 nm下的消光系数为 1.505～1.506，预测半衰期为30 h，不稳定指数为33.63，脂肪指数为87.03，亲水性总平均值为 -0.299，为稳定的亲水性蛋白。

基因(TraesCS5B02G382300)位于小麦基因组5B染色体560 441 118～560 444 767区间，基因全长为3 650 bp，编码864个氨基酸。该蛋白的相对分子量为 96.5 kDa，理论等电点为6.10，属于酸性蛋白；280 nm下的消光系数为 1.509～1.510，预测半衰期为30 h，不稳定指数为32.85，脂肪指数为87.37，亲水性总平均值为-0.280，为稳定的亲水性蛋白。

基因(TraesCS5D02G388700)位于基因组5D染色体458 094 426～458 098 176区间，基因全长为3 751 bp，编码864个氨基酸。蛋白分子量为96.6 kDa，理论等电点为 6.17，属弱酸性蛋白；280 nm下的消光系数为1.508～ 1.510，预测半衰期为30 h，不稳定指数为34.46，脂肪指数为87.14，亲水性平均值为 -0.283，为稳定亲水性蛋白。

2.2.2 亚细胞定位预测结果

利用ProtComp 9.0在线程序对、和基因编码的蛋白分别进行亚细胞定位预测，预测结果显示这些蛋白均位于细胞质中。

2.2.3 TaLOX2蛋白二、三级结构预测结果

TaLOX2A蛋白二级结构预测结果(图1A)显示，无规则卷曲占44.33%，α-螺旋占 36.11%，延伸链占14.00%，β-转角占5.56%，表明该蛋白为无规则卷曲型。同源建模SWISS-MODEL在线程序对其蛋白三级结构建模，结果显示该蛋白为3pzw.1.A，与模板序列相似度为55.95%，GMQE值为0.79，QMEAN值为 -1.72。

图1 TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D蛋白二级(左)、三级(右)结构预测

TaLOX2B蛋白二级结构预测结果(图1B)显示，无规则卷曲占43.98%，α-螺旋占36.46%，延伸链占14.24%，β-转角占5.32%，表明该蛋白为无规则卷曲型。同源建模SWISS-MODEL在线程序对其蛋白三级结构建模，结果与TaLOX2A一致。

TaLOX2D蛋白二级结构预测结果(图1D)显示，无规则卷曲占43.52%，α-螺旋占 37.62%，延伸链占13.77%，β-转角占5.09%，表明该蛋白为无规则卷曲型。同源建模SWISS-MODEL在线程序对其蛋白三级结构建模，结果显示该蛋白为3pzw.1.A，与模板序列相似度为 55.58%，GMQE值为0.79，QMEAN值为-1.63。

2.2.4 进化树与基序分析

利用MEGA 6软件的N-J法对冬小麦Dn1中TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D蛋白以及拟南芥、水稻、大豆()、玉米()、大麦(subsp.)、燕麦()和高粱()的LOX2蛋白进行系统进化分析，结果(图2)表明，Dn1中TaLOX2A蛋白与TaLOX2D蛋白同源性最高，二者与TaLOX2B蛋白聚类在一个大分支上，且这三个蛋白与大麦LOX2蛋白亲缘性较近，与拟南芥、水稻LOX2蛋白亲缘性较远。基序分析结果(图3)显示，TaLOX2A、TaLOX2B、TaLOX2D蛋白含有相同的结构域，均属于LOXs家族蛋白，与大麦、燕麦、玉米、大豆、高粱均含有10个相同的基序；而拟南芥、水稻含有8个相同的基序，说明LOX2蛋白保守性较高。推测小麦LOX2蛋白可能与拟南芥、水稻LOX2蛋白行使的功能存在一定差异，也验证了系统进化树分析结果。

图2 不同物种LOX2蛋白系统进化树分析

Zm： 玉米；Sb：高粱；As:燕麦；Hv：大麦；Ta：小麦；Gm:大豆；At：拟南芥；Os：水稻。

3 讨 论

Dn1安全越冬的主要部位是分蘖节。本研究发现，低温处理提高了Dn1分蘖节中、、和的相对表达量，在-10 ℃表达量达到最大值，这与我们前期发现Dn1分蘖节中JA响应基因(响应内源JA水平)和JA信号转导基因的表达量在-10 ℃最高一致，表明低温诱导JA合成基因的表达，进而提高内源JA的含量。另外，本研究发现，外源MeJA处理显著提高了0 ℃下分蘖节中、、、和的表达量，表明MeJA处理使JA合成基因的表达提前，为抵御持续低温的到来做好了抗寒准备。

JA 的生物合成是通过JA生物合成基因、、和的作用完成的，可提高低温胁迫下作物的抗寒性。LOX2是JA生物合成的关键酶。研究表明，外源MeJA处理可诱导辣椒基因上调表达，提高番石榴果实的LOX活性，进而使其有效抵抗低温胁迫。本研究发现，外源MeJA处理提高了分蘖节在0 ℃下的表达量，降低了在-10 ℃下的表达量；而0 ℃和-10 ℃下、、的表达量均有所下降。原因可能是的表达量是针对A、B、D亚基因组的同源区定量，而、、的表达量是针对这三个同源基因的特异区段定量，由于其序列的高度相似性使得特异区段的选择受限，导致和、、表达量变化趋势出现不一致。前人研究表明，家族各成员在不同胁迫或者同一胁迫反应中表现为协同或拮抗效应，从而表现出相似或相反的响应。本研究发现，低温胁迫提高了分蘖节中和的表达量，降低了的表达量，同时叶片中LOX1、LOX2、LOX3的表达量均有所提高，表明分蘖节家族各成员对低温胁迫表现出拮抗的反应，而叶片则表现出协同的反应。这可能与叶片在极低温度下被积雪覆盖或被寒风抽干，代谢减弱；而分蘖节被土层覆盖，是Dn1安全越冬的主要部位有关。

在拟南芥、大豆等植物中发现，LOX2-AOS-AOC复合物促进了JA的生物合成。本研究初步探讨了低温胁迫和外源MeJA处理下Dn1中JA合成基因的表达量变化及JA合成关键酶基因不同亚基因组同源基因表达量的变化。推测Dn1中也存在LOX2-AOS-AOC复合物，促进JA的生物合成，但还有待进一步研究。