■ 文｜深圳市渔业发展研究中心 黄浦江 徐远珍

罗非鱼原产于非洲，包括亚种在内共计100多种。罗非鱼肉质鲜美，无间刺，蛋白含量高，富含8种人体所需的必需氨基酸、不饱和脂肪酸等，素有“白肉三文鱼”之称。同时，因其具有生长快、食性杂、耐低氧、繁殖能力强等特点，被评定为最具发展潜力的淡水特色优势品种。

甲基营养型芽孢杆菌抗菌肽在生物保鲜剂上具有广阔的应用前景，甲基营养型芽孢杆菌产生的抗菌肽可使罗非鱼片保质期延长4d以上。甲基营养型芽孢杆菌的抑菌代谢产物常见有：抑菌蛋白、蛋白酶、纤维素酶、氨肽酶、抑菌肽等，甲基营养型芽孢杆菌在细菌病的治疗和食物保鲜上具有广阔的前景。本研究使用的甲基营养型芽孢杆菌采自于深圳某罗非鱼养殖场罗非鱼肠道，研究人员对其进行了革兰氏染色、16S rRNA鉴定及生化鉴定，旨在为今后筛选提高罗非鱼抗病能力、促进罗非鱼健康生长的甲基营养型芽孢杆菌提供理论依据，从而为研发甲基营养型芽孢杆菌在罗非鱼及其他经济水产动物养殖上的应用提供参考。

材料与方法

1.甲基营养型芽孢杆菌分离纯化

本次使用的罗非鱼（200±50）g置于超净工作台中，用75%的酒精棉球擦拭鱼体表面，解剖取出肠道。用无菌生理盐水冲洗数遍，清除肠道内容物，置于玻璃匀浆器中加入1mL生理盐水进行研磨，研磨充分后用三倍无菌生理盐水连续稀释，用涡旋搅拌机混匀，分别涂布于TSA、MRS、TPY、PDA平板上，每个平板涂布100μL，各种平板设置6个重复，其中3个置于30℃无氧条件中培养，另外3个置于30℃有氧条件中培养。48h后挑取单个菌落，反复划线分离至获得纯菌株。通过革兰氏染色、镜检，初步筛选出革兰氏阳性杆菌。

2.甲基营养型芽孢杆菌的鉴定

挑取上述从罗非鱼肠道分离出的革兰氏阳性菌株，提取其DNA，送公司测序。利用NCBI的Blast程序比对分析16S rRNA基因序列测序结果。利用最大简约法和邻接法进行分析，用MEGA6软件构建系统发育树，重复次数为1000。

3.生化鉴定

菌株的生化鉴定主要通过HBI蜡样芽孢杆菌生化鉴定条和单盒生化鉴定管来鉴定。鉴定方法遵照鉴定条（管）使用说明书中的方法，在超净工作台上操作，用酒精棉球擦拭鉴定条（管），鉴定条用打孔器打孔，鉴定管用镊子打开铝盖，注入100μL菌悬液，封盖培养，培养条件、时间及结果判定参照说明书。

结果与分析

1.甲基营养型芽孢杆菌的分离

从罗非鱼肠道中分离出1株甲基营养型芽孢杆菌，命名为TPS-A。分离得到的菌株革兰氏染色为阳性，显微镜下观察为杆状（图1）。

图1 菌株TPS-A革兰氏染色图

2.甲基营养型芽孢杆菌的鉴定

采用16sRNA PCR技术对该菌株进行鉴定。经广州生工生物技术有限公司测序证实，菌株TPS-A的DNA bp值为1454（图2），基因库编号为MK130896。

图2 泳道M：DNA marker DL 2000泳道1：TPS-A PCR 产物

系统发育分析表明（图3），菌株TPS-A与B.methylotrophicus strain CBMB205、B.velezensis strain FZB42、B.siamensis strain PD-A10的相似性分别为99.79%、98.26%、95.34%，与B.methylotrophicus strain一类物种的亲缘关系最高且聚为一支，所以推荐鉴定该菌种为B.methylotrophicus strain。

图3 基于TPS-A 16S rRNA 基因序列构建的系统发育树

3.生化鉴定结果

根据生化鉴定条（管）说明书提供的判定标准，得出菌株TPS-A的生理生化特性如表1。菌株TPS-A，淀粉水解试验、硝酸盐肉汤试验等试验均为阳性，溶酶菌肉汤试验、VP试验、甲基红试验、精氨酸双水解酶试验等试验均为阴性，糖发酵结果为，菌株TPS-A可以发酵葡萄糖，不能发酵肌醇等。

表1 罗非鱼肠道分离芽孢杆菌TPS-A 的生化鉴定结果

结论

本次研究通过平板划线分离、革兰氏染色、镜检、16S rRNA以及生理生化鉴定等方法，成功从罗非鱼肠道中分离得到了一株甲基营养型芽孢杆菌，因其不具有常用抗生素耐药性基因，使得这菌株在耐药性基因产生、转移等相关研究中具有广阔的前景，也能为罗非鱼源甲基营养型芽孢杆菌的筛选、鉴定、分析和应用提供参考。