罗祥敏，杨兴变，雷 芳，都国栋，何 珺**

（1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 生化工程中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025）

引 言

银杏叶具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效[1]，主要含有黄酮类、萜内酯类、有机酸类、酚类等活性成分[2]。银杏叶提取物是银杏叶经过提取、柱层析纯化得到的产物，具有扩血管、清除体内自由基、抗心肌缺血、抗氧化及改善高血压脑出血术后患者神经功能等作用[3～6]。2020 年版药典要求银杏叶中总黄酮含量≥0.40%、总萜内酯含量≥0.25%，指纹图谱相似度＞0.9[7]。近年来，随着有机酸类活性成分研究的深入[8]，银杏叶及制剂中的有机酸的药理作用越来越受到关注[9～13]。莽草酸具有镇痛、抗炎、抗脑缺血等药理作用，是抗禽流感药物“达菲”的重要合成前体[14]；绿原酸具有心血管保护、抗诱变、抗癌、抗白血病、抗菌、抗病毒、降脂、降糖等作用[15]。在银杏叶提取物生产过程中，柱层析废液中含有大量莽草酸，对其进行回收提纯，制备高纯度莽草酸是很有意义的。已有文献报告，银杏叶中总黄酮及总萜内酯含量受到产地、树龄及干燥方式等因素影响[16～21]。但对银杏叶中的有机酸莽草酸和绿原酸的相关报告鲜少。因此，为了银杏叶的综合利用开发，对不同树龄及不同采收月份的银杏叶中的总黄酮、总萜内酯、莽草酸及绿原酸进行HPLC含量分析，探索出其分布规律。这对科学合理地充分使用银杏叶资源，实现其资源高效综合利用，具有较大的经济及社会意义。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（Agilent1100），美国；超高效液相色谱仪（岛津LC-2040C 3D），日本；超声波清洗器（KQ3200DE），昆山市超声仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（GZX-9140 MBE），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；电子分析天平（BT25S），塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；电热恒温水浴锅（HH.W21-600C），北京长源实验设备厂；其他为一般常规仪器。

甲醇、乙腈（色谱纯），德国MERCK 公司；水为娃哈哈纯净水。

1.2 实验对照品及供试品

对照品：槲皮素（110862-201510）、山柰素（110861-201310）、异鼠李素（110860-201410）、银杏内酯A（10011506）、银杏内酯B（110863-200508）、银杏内酯C（09102111）及白果内酯（09082711），以上试剂均购于中国食品药品检定研究院；莽草酸标准品（18071724，纯度98%）及绿原酸标准品（09081633，纯度98%）购于上海同田生物技术股份有限公司。

供试品：不同树龄银杏叶（1 年、2 年、3 年、4 年、5 年、6 年、7 年、8 年、10 年、100 年、200 年）于2020年8 月份采自贵州省银杏种植基地；不同采摘期银杏叶（4 月至11 月，为2020 年采自贵州贵阳）。

2 实验方法

2.1 4 种活性成分HPLC 测定色谱条件

总黄酮色谱条件：LC-2040C 3D 超高效液相色谱仪，DAD 检测器，C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸水（50∶50），流速为1mL·min-1，波长为360nm，进样量10μL，柱温50℃。

总萜内酯色谱条件：Agilent1100 高效液相色谱仪，RID 检测器，ODS-U 色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇- 水（30∶70），流速为1mL·min-1，进样量10μL，柱温30℃。

莽草酸色谱条件：LC-2040C 3D 超高效液相色谱仪，DAD 检测器，Inertsil 氨基柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水（15∶85），流速为1mL·min-1，波长为213nm进样量10μL，柱温25℃。

绿原酸色谱条件：LC-2040C 3D 超高效液相色谱仪，DAD 检测器，C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水（11∶89），流速为0.8mL·min-1，波长为324nm，进样量10μL，柱温35℃。

图1 供试品中黄酮色谱分析图Fig.1 The chromatographic analysis of flavonoids in test products

图2 供试品中莽草酸色谱分析图Fig.2 The chromatographic analysis of shikimic acid in test products

图3 供试品中总萜内酯色谱分析图Fig.3 The chromatographic analysis of total terpene lactones in test samples

2.2 对照品溶液的制备

总黄酮对照品制备：精密称取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量置于50mL 容量瓶中，加甲醇将其配制成每1mL 含槲皮素30μg、山柰素30μg、异鼠李素20μg 的混合溶液，过0.45μm 滤膜即得。

总萜内酯对照品制备：精密称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯对照品适量放置于50mL 容量瓶中，加50%甲醇配制成每1mL 含银杏内酯A0.18mg、银杏内酯B0.08mg、银杏内酯C0.10mg、白果内酯0.20mg 的混合溶液，过0.45μm 滤膜即得。

绿原酸对照品制备：精密称取绿原酸对照品适量置于50mL 容量瓶中，加10%甲醇配制成0.215mg·mL-1绿原酸对照品溶液。

莽草酸对照品制备：精密称取莽草酸对照品适量放置于50mL容量瓶中，加10%甲醇配制成0.120mg·mL-1莽草酸对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

总黄酮供试品制备：精密称取0.1g 不同树龄及不同采摘期的银杏叶样品置于10mL 具塞管中，加入固体水解液（甲醇∶纯水∶浓盐酸=7∶2∶1）后，超声5min，将其放置于68℃水浴锅中3h 后取出放冷至室温，用0.45μm 滤膜过滤即得。

总萜内酯供试品制备：精密称取0.2g 不同树龄及不同采摘期的银杏叶样品置于10mL 具塞管中，分别加入3mL 甲醇溶液超声5min，放置于68℃水浴锅中，30min 取出放冷至室温，再加入2mL 水继续超声2min 混匀，过酸性Al2O3即得。

莽草酸供试品制备：精密称取0.1g 不同树龄及不同采摘期的银杏叶样品置于10mL 具塞管中，加10mL 水在40℃中超声30min，取出放冷，过微滤即得。

绿原酸供试品制备：精密称取0.15g 不同树龄及不同采摘期的银杏叶样品置于10mL 具塞管中，加10mL 水后在40℃中超声30min，取出放冷，用0.45μm 滤膜过滤即得。

2.4 含量测定及计算方法

分别将对应的对照品溶液与供试品溶液进样到相应高效液相色谱仪，按照2.1 项下的色谱条件测定，进样10μL，记录各自的峰面积，绿原酸和莽草酸含量按公式（1）计算，总黄酮和总萜内酯含量按公式（1）、（2）和（3）计算：

式中：C标表示对照品质量浓度（mg·mL-1）；A样表示样品峰面积；V 表示提取液体积（mL）；X 表示对照品的纯度；A标表示对照品峰面积；m 表示样品质量（mg）。

3 结果与分析

3.1 方法学考察

3.1.1 精密度考察

精密吸取2.3 节下贵州贵阳九月份总黄酮、总萜内酯、莽草酸及绿原酸各一个供试品溶液，按2.1节下色谱条件分别测定各供试品5 次，记录峰面积并计算RSD 值，总黄酮RSD=0.58%，总萜内酯RSD=0.86%，绿原酸RSD=0.66%，莽草酸RSD=0.69%，表明该测定方法精密度良好。

3.1.2 重复性考察

精密称取同一样品5 份，按2.3 节下供试品制备方法制备供试品溶液，按2.1 节下色谱条件分别测定，记录峰面积并计算RSD 值，总黄酮RSD=0.98%，总萜内酯RSD=1.07%，绿原酸RSD=1.08%，莽草酸RSD=1.20%，表明各测定方法重复性良好。

3.1.3 稳定性考察

分别吸取2.3 节下的一个总黄酮、总萜内酯、莽草酸及绿原酸供试品溶液，分别放置6、12、18、24、30、36、42、48h 后分别按2.1 项方法进样检测，记录峰面积并计算RSD值，总黄酮RSD=0.56%，总萜内酯RSD=0.58%，绿原酸RSD=0.98%，莽草酸RSD=0.85%。显示样品在48h 内稳定性良好。

3.1.4 加标回收率考察

精密称取1g 已知含量的叶子供试品各3 份，分别加入2.2 项对照品溶液5mL，按2.1 项下方法进样检测，计算平均加标回收率和RSD 值，结果见表1。

表1 银杏叶中4 种活性成分的加标回收率试验结果（n=3）Table 1 The standard recovery rate test results of 4 kinds of active ingredients in ginkgo biloba leaves（n=3）

3.2 不同树龄银杏叶中4 种活性成分含量比较

采收贵州省银杏种植基地8 月份不同树龄的银杏叶，均在相同烘干条件下干燥、粉碎。按照2.3 项供试品溶液制备方法制备，分别按照2.1 项下色谱条件进样检测，结果见表2。

表2 不同树龄银杏叶中4 种活性成分含量（n=3）Table 2 The contents of 4 kinds of active ingredients in ginkgo biloba leaves of different tree ages（n=3）

由表2 可知：不同树龄的银杏叶中活性成分含量不同，树龄对银杏叶中绿原酸、总黄酮、总萜内酯含量有较大影响，莽草酸含量受树龄影响较小。1～4年树龄的银杏叶中总黄酮、绿原酸均较高，5～10 年总黄酮、总萜内酯均达到药典要求，而上100 年的银杏叶中总黄酮含量还保持高于0.40%，但总萜内酯含量低于0.25%，质量达不到药典要求。因此，建议使用树龄不高于10 年的银杏叶为4 种活性成分综合利用的提取原料。

3.3 不同年生长月份银杏叶中4 种活性成分含量比较

采收4 月至11 月贵州贵阳银杏叶，均在相同条件下烘干、粉碎，按照2.3 节下供试品溶液制备方法制备供试品，分别按照2.1 色谱条件进行测定，结果见表3。

表3 不同采收月份银杏叶中4 种活性成分含量（n=3）Table 3 The contents of 4 kinds of active ingredients in ginkgo biloba leaves picked in different months（n=3）

由表可知：4 至9 月份银杏叶中总黄酮和绿原酸含量基本随采摘月份增加而下降，而总萜内酯含量则随叶子年生长月份变大而升高，含量8 月至9 月达到最高，莽草酸含量随月份变化影响较小，平均含量4.28%。总黄酮和绿原酸含量10 月和11 月升高，这可能与应激反应有关。综合4 种活性成分含量、银杏树单株采叶质量及2020 年版药典对银杏叶总萜内酯含量不低于0.25%规定，建议贵州省银杏叶采收季节为8 至9 月最合适。

4 讨 论

本文采用HPLC 法对不同树龄及不同年生长月份的银杏叶中总黄酮、总萜内酯、莽草酸及绿原酸等4 种活性成分进行了含量测定，综合数据分析，选用树龄不高于10 年，采摘月份为8 至9 月的银杏叶作为生产原料较佳。该文研究了银杏叶中4 种活性成分的分布规律，为合理选用银杏叶作为提取原料提供科学理论依据，为国内相关银杏基地采收银杏叶提供数据参考。同时，通过原料质量内控标准稳定生产合格银杏相关制剂，对进一步提高产品安全性和稳定性具有很大的意义。