周 程，汪光亮，潘光玉，廖洪涛，袁树民，谭 宁

(桂林医学院 1.研究生院、2.基础医学院组织与胚胎学教研室、3.生物技术学院生物医学工程教研室、4.基础医学院免疫学教研室、5.基础医学院微生物学教研室,广西 桂林 541000)

肝癌是世界上第六大癌症，据统计，2020年新发病例约90万例，死亡约83万例[1]。目前，手术切除治疗是肝癌的首选治疗方式，但其复发率高。肝癌的新型治疗模式免疫疗法也仍处于起始阶段，总体疗效并不理想，并且存在诸多问题。为此，探索新的治疗方案和治疗药物成为肝癌治疗的关键。

大量研究表明，自噬在肝脏生理和稳态调节中起着重要作用，自噬受损导致包括肝癌在内的各种肝脏疾病发生[2]。自噬对肿瘤发生发展至关重要，在某些情况下，自噬具有癌细胞保护作用，导致癌细胞化疗耐药；在另一些情况下，自噬又具有细胞毒性作用，利用化合物诱导自噬可以介导癌细胞死亡[3]。尽管自噬对肿瘤的作用具有双重性，但是靶向肿瘤细胞自噬逐渐成为肿瘤治疗的热点。Fan等[4]发现，柠檬酸盐通过下调CaMKII/AKT/mTOR途径激活前列腺癌细胞的自噬性死亡。另外，在最近研究中新发现的自噬抑制剂和激活剂3-Methyladenine(3-MA)、SAR405、miconazole(MCZ)、CRO15等正在进行临床前研究，具有重要临床应用前景[5]。

钙通道的异常激活已被证实在肿瘤的发生和发展中起着关键作用[6]。研究发现，钙通道阻滞剂维拉帕米联合多烯紫杉醇或长春新碱能够诱导肺癌耐药细胞自噬爆发和凋亡[7]。硝苯地平(nifedipine)是一种已知的L型钙通道阻滞剂，是世界卫生组织(WHO)基本药物目录中最有效、最安全的药物之一。其通过阻断L型电压依赖性钙通道(L-type voltage dependent calcium channel，L-VDCC)，减少钙离子内流进入血管平滑肌和心肌细胞而达到降压作用，故临床上广泛用于高血压的治疗。虽然硝苯地平长期作为抗高血压药物用于临床，但有文献报道，硝苯地平在肺癌[8]、卵巢癌[9]、结肠癌[10]中均表现出抗肿瘤作用。目前，硝苯地平对肝癌的作用及机制研究鲜有文献报道，本研究将探讨硝苯地平对肝癌细胞增殖和自噬的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 肝癌细胞株Huh-7(购自中科院上海生物科学研究所细胞资源中心)，稳定过表达GFP-LC3B肝癌细胞株Huh-7(由暨南大学医院肿瘤精准医学和病理研究所张灏教授馈赠)。

1.1.2药物与试剂 硝苯地平(分子式C17H18N2O6，CAS号：21829-25-4，纯度≥98%，Sigma公司)；DMEM高糖培养基(Sigma-Aldrich公司，D2438)；胎牛血清FBS(Corille公司，C1015-05)；BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo公司，#23327)；Cell Counting Kit-8试剂(上海同仁化学研究所，CK04)；单克隆抗体LC3B(3868S)、单克隆抗体Beclin1(3595P)、单克隆抗体Atg7(8558P)、单克隆抗体Atg3(3415P)、单克隆抗体Atg5(12994P)均购自CST公司，抗α-tubulin一抗(66031-1-Ig)购自Proteintech公司。

1.1.3仪器 Elix3+30 L+3YNERGY超纯水系统(美国Millipore公司)；311气套式CO2培养箱(美国Thermo公司)；Infinite M200 pro Nano Quant光栅型连续波长酶标仪(瑞士TECAN公司)；Allegra X-22R冷冻离心机(美国Beckman公司)；ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；LSM710激光共聚焦扫描显微镜(德国ZEISS公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将Huh-7细胞接种于DMEM培养基中，培养于37 ℃、5%CO2培养箱中，胰蛋白酶常规消化传代，选择处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2药物IC50实验 胰酶室温常规消化细胞后，用含FBS的DMEM培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，以每孔4 000个细胞的密度接种于96孔板中，继续培养于37 ℃、5% CO2培养箱中。细胞贴壁生长24 h后，加入硝苯地平进行干预，使其终浓度分别为0.195、0.391、0.781、1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·L-1，对照组给予与硝苯地平处理组对应的DMSO，每一浓度设置3个复孔。2 d后弃去细胞培养液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，继续培养2 h。使用酶标仪检测450 nm波长处吸光值。利用GraphPad Prism 8.0软件计算IC50。

1.2.3细胞增殖实验 胰酶室温常规消化细胞后，用含FBS的DMEM培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，以每孔2 000个细胞的密度接种于96孔板中，继续培养于37 ℃、5% CO2培养箱中。细胞贴壁生长24 h后，加入硝苯地平进行干预，使其终浓度分别为1.562、3.125、6.25、12.5、25 mg·L-1，对照组给予等体积DMSO(以25 mg·L-1硝苯地平处理组为对照)，每一浓度设置3个复孔。分别干预细胞2 h，1、2、3、4、5 d后弃去细胞培养液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，继续培养2 h。使用酶标仪检测450 nm波长处吸光值。细胞增殖抑制率计算公式：增殖抑制率/%=(1-药物组OD450 nm值/对照组OD450 nm值)×100%。

1.2.4克隆形成实验 胰酶室温常规消化细胞后，用含10% FBS的高糖培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，以每孔2 500个细胞的密度接种于6孔板中，继续培养于37 ℃、5% CO2培养箱中。培养10 d后加硝苯地平，使其终浓度为25 mg·L-1，对照组给予等体积DMSO(以25 mg·L-1硝苯地平处理组为对照)，各设置6个复孔。再继续培养6 d后弃去上层培养液，PBS轻柔洗板2次，细胞用4%多聚甲醛固定15 min。弃去多聚甲醛，结晶紫溶液染色15 min，清水反复浸洗，室温晾干，采集图像保存后，每孔加入2 mL 10%的冰醋酸溶液溶解结晶紫，每孔再取100 μL置于96孔板中。使用酶标仪检测各孔560 nm波长处吸光度值[10]。细胞克隆抑制率公式：克隆抑制率/%=(1-药物组OD560 nm值/对照组OD560 nm值)×100%。

1.2.5Western blot检测 将Huh-7细胞室温消化后接种于培养皿中，24 h贴壁后，加入硝苯地平进行干预，使其终浓度为0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25 mg·L-1，对照组给予等体积DMSO(以25 mg·L-1硝苯地平处理组为对照)。作用2 d后收集细胞，采用RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，再在蛋白样品中加入上样缓冲液混匀后，95 ℃金属浴10 min，冰上放置10 min后，保存于-20 ℃冰箱备用。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白样品，转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉(TBST配制)室温摇床封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗膜5次，每次10 min。5%脱脂奶粉(TBST配制)室温摇床封闭0.5 h，室温孵育二抗1.5 h，TBST洗膜5次，每次10 min。与ECL发光液反应2～3 min后，X线片曝光、显影、定影。采用Gel-Pro Analyzer图像分析系统计算分析X线片吸光度值。

1.2.6激光共聚焦检测 胰酶室温常规消化稳定过表达GFP-LC3B的Huh-7细胞后，用含FBS的DMEM培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，按每孔1×105个细胞的密度接种于35 mm激光共聚焦观测培养皿中，继续培养于恒温培养箱中。细胞贴壁24 h后，加入硝苯地平进行干预，使其终浓度为6.25、25 mg·L-1，对照组给予等体积DMSO(以25 mg·L-1硝苯地平处理组为对照)。再继续培养2 d后，-20 ℃预冷的无水甲醇进行固定。PBS漂洗3次，每次5 min，进行DAPI染色。PBS漂洗3次，每次5 min，使用荧光抗淬灭剂进行封片。通过激光共聚焦显微镜采集图像，GFP检测波长为510～550 nm，DAPI检测波长为450～470 nm。

2 结果

2.1 硝苯地平对Huh-7细胞增殖的抑制作用CCK-8结果显示，不同浓度的硝苯地平干预Huh-7细胞2 d后，硝苯地平剂量在12.5 mg·L-1开始对Huh-7细胞表现出明显的抑制作用，且随着药物浓度的升高抑制作用越明显，呈剂量效应依赖性，见Fig 1A。2 d时硝苯地平的半数抑制浓度(IC50)为22.7 mg·L-1，硝苯地平12.5、25 mg·L-1的细胞增殖抑制率结果分别(36.62 ± 2.48)%、(60.04 ± 2.10)%。为了证明硝苯地平作用时间对肝癌细胞的影响，我们用硝苯地平(1.562、3.125、6.25、12.5、25 mg·L-1)干预Huh-7细胞2 h，1、2、3、4、5 d，结果显示，硝苯地平对Huh-7细胞表现出的抑制作用随浓度或时间的增加而增强，见Fig 1B。

Fig 1 The inhibitory effect of nifedipine on proliferation of hepatoma cell line Huh-7 n=3)A:Different concentrations of nifedipine intervened Huh-7 cells for 2 days;B:Different concentrations of nifedipine intervened for 2 h,1 d,2 d,3 d,4 d and 5 d.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 2 Clone formation of hepatoma cell line Huh-7 inhibited by nifedipine n=6)**P<0.01 vs control group

2.2 硝苯地平对Huh-7细胞克隆形成的影响采用克隆形成实验观察硝苯地平对Huh-7细胞集落形成能力的影响，结果发现，硝苯地平(25 mg·L-1)干预后，与对照组相比，结晶紫阳性染色明显减少，Huh-7细胞的克隆形成率显著降低，克隆形成的抑制率为(95.46±0.45)%。

2.3 硝苯地平对LC3B-Ⅱ、Beclin1蛋白表达的影响Western blot结果表明，硝苯地平(0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25 mg·L-1)干预Huh-7细胞后，自噬相关蛋白(Atg)7、Atg3、Atg5表达无明显变化，Ⅱ型微管相关蛋白轻链3B(LC3B-Ⅱ)的表达水平随浓度而增加，Beclin1蛋白表达水平也上调，见Fig 3。提示硝苯地平对肝癌细胞的自噬小体形成具有明显的促进作用。

2.4 硝苯地平对稳定表达GFP-LC3B肝癌细胞Huh-7自噬小体形成的影响对GFP-LC3B稳定表达的Huh-7细胞进行硝苯地平(6.25、25 mg·L-1)干预，24 h后使用激光共聚焦显微镜进行观测。结果显示，硝苯地平可以促进GFP-LC3B的聚集，在细胞内形成了绿色荧光富集区。荧光光密度分析结果提示，硝苯地平组GFP荧光密度明显增高，见Fig 4。提示硝苯地平可以促进自噬小体形成。

Fig 3 Effect of nifedipine on LC3B-Ⅱ and Beclin1 protein expression n=3)A:Western blot detected the expression of autophagy related proteins;B:The relative expression of proteins,alpha-tubulin was used as an internal control.**P<0.01 vs control group

Fig 4 Effect of nifedipine on formation of autophagosomes in Huh-7 hepatoma cells stably expressing GFP-LC3B n=3)**P<0.01 vs control group

3 讨论

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，严重的威胁着我国人民的生命健康。研究发现，钙离子与肿瘤的发生和发展密切相关，维拉帕米、地尔硫卓等包括硝苯地平在内的多种钙通道阻滞剂均被报道具有肿瘤抑制作用[6]。其中，与其它阻滞剂相比，硝苯地平凭借其作为几十年畅销药的安全性更值得在抗肿瘤药物的探索中被关注。本研究中，以人肝癌细胞Huh-7为研究对象，硝苯地平进行干预，检测硝苯地平对肝癌细胞增殖抑制的作用。CCK-8结果提示，硝苯地平对Huh-7细胞增殖具有明显的抑制作用，并随着药物浓度和时间的增加抑制作用增强；细胞克隆形成实验结果显示，肝癌细胞Huh-7具有较强增殖能力，但在25 mg·L-1剂量的硝苯地平作用下表现出显著的增殖抑制作用。以上结果表明硝苯地平对肝癌细胞具有良好的体外抗肿瘤效应。

自噬在肿瘤的发生发展中具有双重作用，一方面，自噬在氧化应激与机体防御中，维持基因组的稳定性起到抑癌作用[5]；另一方面，细胞内代谢产物的循环利用，让肿瘤细胞在营养压力、缺氧和细胞毒性治疗中得以生存[12]。尽管癌症治疗过程中自噬的应用存在争议，但不可否认自噬抑制剂和诱导剂在癌症治疗中都是有用的。自噬抑制剂与化疗药物的联合可导致癌细胞对化疗药物敏感，从而提高其疗效；相反，自噬的过度激活(自噬诱导剂)会导致细胞失去对这种生存机制激活的控制，从而导致自噬介导的细胞死亡[3]。自噬是细胞成分选择性降解的重要过程。自噬首先形成杯状双层膜结构，包围并隔离细胞器和蛋白质，进一步延伸、封闭而形成自噬小体。然后自噬小体经历一个逐步成熟的过程，与溶酶体融合，最终导致自噬小体内容物传递到溶酶体进行降解和循环。LC3与自噬小体的形成有关，LC3包括LC3A、LC3B、LC3C 3种亚型，其中LC3B-Ⅱ是由LC3B-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺(PE)结合而形成的一种难以降解的蛋白质，已知其水平与自噬体的数量相关[13-14]。在本研究中，在硝苯地平进行干预后通过Western blot检测LC3B-Ⅱ的变化，结果显示，LC3B-Ⅱ蛋白表达增加，表明硝苯地平促进自噬小体的形成，增加了自噬小体的数量。另外，通过激光共聚焦显微成像技术观测稳定过表达GFP-LC3B的Huh-7细胞在硝苯地平干预后的改变，结果显示，GFP-LC3B聚集增加，GFP荧光密度明显增高，进一步证明硝苯地平促进自噬小体的形成，表明硝苯地平抑制Huh-7细胞增殖与细胞自噬有关。

哺乳动物自噬基因Beclin1位于染色体17q21上，在高达50%的乳腺癌、75%的卵巢癌以及40%的前列腺癌中发现该区域的单等位基因缺失[15]。Beclin1对自噬蛋白定位到自噬前体结构(PAS)具有重要意义，其与Ⅲ类磷酸肌醇3-激酶(PI3KC3)/液泡分选蛋白(Vps)34相互作用，形成Beclin1-Vps34-Vps15核心复合体[16]。该复合促进PI3P的产生，从而促进自噬小体的形成[17]。在本研究中，同样对Huh-7细胞进行硝苯地平干预，通过Western blot检测发现，Beclin1蛋白表达水平随硝苯地平浓度的增加而上调，这提示硝苯地平可能通过上调Beclin1蛋白从而促进自噬小体的形成。

综上，硝苯地平可抑制肝癌细胞Huh-7增殖，引起LC3B-Ⅱ和Beclin1蛋白的改变，同时，促进肝癌细胞Huh-7自噬小体形成，这可能与细胞自噬有关。本研究将提供一个潜在的以自噬为靶向的抗肝癌药物。