陈海伟，刘明强，张广智，康学文

（兰州大学第二医院骨科，甘肃 兰州 730030）

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）是一种临床常见的肌肉骨骼系统退行性疾病，大约70%～85%的人一生中至少会经历一次腰痛，严重降低了生活质量［1］。然而，IDD的具体发病机制尚不完全清楚。目前认为，多种因素参与IDD的发生发展，例如：炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍、机械负荷异常、营养剥夺和遗传因素等［2～4］。核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2）是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，同时也是维持细胞内稳态的中枢调节者。Nrf2是调控IDD细胞内稳态的关键调节因子，有可能作为治疗IDD的潜在靶点。本文就这方面研究进展作一综述，为后续相关研究提供参考。

1 Nrf2的结构与功能

Nrf2是亮氨酸拉链（basic leucine zipper,bZIP）转录因子，由7个Nrf2-ECH同源结构域（Neh1–7）的模块蛋白组成，每个域具有不同的功能［5］。Neh1结构域的氨基酸序列是高度保守的基本区域，可介导Nrf2与抗氧化反应元件（antioxidant response elements,ARE）序列的结合；Neh2结构域介导与Nrf2负调控因子Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）和7个赖氨酸残基的相互作用，用于Nrf2的泛素化和随后的蛋白酶体降解；C端Neh3结构域具有反转录活性，并与Neh4和Neh5结构域协同激活Nrf2靶基因的转录；Neh6域是一个富含丝氨酸的区域，参与独立于Keap1的Nrf2稳定性的负调节；Neh7结构域抑制Nrf2的转录活性［6］。

Nrf2可通过协同诱导ARE驱动的细胞保护性基因转录来抵消氧化应激、炎症和线粒体功能障碍［7］；其中ARE的基因包括NAD（P）H醌氧化还原酶（NQO1），血红素加氧酶-1（HO-1），超氧化物歧化酶1（SOD-1），过氧化氢酶1，谷胱甘肽过氧化物酶，谷胱甘肽还原酶，过氧化物酶等等。Nrf2的功能通过增加ARE下游基因表达来体现［8］。因此，Nrf2及其下游基因对于细胞稳态的维持至关重要。

2 椎间盘的结构及Nrf2的表达

椎间盘（intervertebral disc,IVD）是一个复杂的结构，由周围部的纤维环（anulus fibrosus,AF）、中间部的髓核（nucleus pulposus,NP）和连接上下椎体的软骨终板（cartilage endplate,CEP）三部分构成［9，10］。AF由一系列同心片层组成，主要由相互交替I型胶原纤维束构成，提供抗拉强度；NP主要由富含II型胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）组成，其中蛋白聚糖是高负离子的物质，提供渗透特性，使NP在压缩载荷下保持高度和膨胀；CEP在结构上将椎间盘固定在相邻的椎骨上，其细胞外基质主要富含II型胶原蛋白和蛋白多糖［11］。椎间盘退变的特点是细胞外基质破坏增加，基质合成异常，椎间盘高度丧失，导致神经根受到压迫，产生下腰痛。最近研究表明，IDD患者NP组织中Nrf2的表达随着NP变性加重而逐渐降低，且Nrf2的缺乏会加剧NP细胞衰老［12］。因此，Nrf2的缺乏可能参与了IDD的发生发展。

3 Nrf2的表达受到非编码RNA调控

最近研究表明，非编码RNA（noncoding RNAs,ncRNAs）在转录后调节基因表达，并在IDD过程中起关键作用［13］。已经证实多种miRNA参与细胞凋亡，细胞外基质的降解，炎症反应及软骨终板的退变［14］。最近研究表明，lncRNA能够通过调节Nrf2的表达，参与IDD的进程。Li等［15］用实时定量PCR分析临床组织标本，结果显示LncRNA NEAT1表达水平随IDD等级的增加而增加；在人NP细胞中，转染lncRNA NEAT1使其过表达，可导致Nrf2的表达降低。同样，Kang等［16］用实时定量PCR检测ln⁃cRNA ANPODRT的表达，结果显示ANPODRT的表达随着IDD等级的增加而减少；在NP细胞中，转染ANPODRT使其过表达，可以破坏Keap1与Nrf2缔合，从而抑制其下游靶基因的激活。这些结果表明，表观遗传学中的ncRNAs可能调控Nrf2及其下游分子的表达，减缓IDD的发展 （图1）。

4 Nrf2在IDD的作用机制

4.1 Nrf2在IDD中的抗氧化作用

氧化应激可以定义为促氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡，导致过量的活性氧（ROS）对细胞的损伤。ROS包括超过氧化阴离子（O2-），羟基自由基（-OH）和过氧自由基（ROO-），是正常细胞内代谢产生的一种信号分子，可促进细胞生存和组织更新或抑制细胞生存基因的表达［17，18］。研究表明，随着IDD的进展，IVD中的ROS产生增加［19］。过量ROS破坏细胞内氧化还原稳态，可使NP细胞衰老和凋亡加速，且形成炎症微环境，最终导致ECM降解增加。Nrf2在抑制氧化应激中起关键作用，能够激活下游基因的转录，包括NAD（P）H醌氧化还原酶1（NQO1），血红素加氧酶1（HO-1）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）等［20］。TBHP 和 H2O2是氧化应激反应的诱导剂。Tang等［12］研究发现，Nrf2的表达与人体椎间盘退变呈负相关，H2O2诱导大鼠NP细胞发生退变，导致Nrf2的表达降低。Ke⁃ap1基因沉默会抑制Keap1与Nrf2的解离，导致p62的表达增加，而其靶基因HO-1和NQO1的表达减少。Bai等［21］用免疫组化显示严重IDD的患者NP存在较高水平的ROS，其研究证实Nrf2的过表达能减少ROS的水平，减轻氧化应激的损伤。这些结果表明Nrf2基因可以调控NP细胞的退变过程。

最近的研究表明，多种化合物单体可以激活Nrf2基因的表达，保护NP细胞免受氧化应激的损伤，从而延缓IDD的进展。金线莲苷是从乌参中提取出来的一种活性化合物，具有肝保护和抗骨质疏松症等功能［22］。Wang 等［23］研究报道，金线莲苷增加Nrf2的表达，减轻由TBHP诱导NP细胞中线粒体ROS的水平，而Nrf2敲除降低了金线莲苷清除ROS的能力。金雀异黄素是豆科植物的天然类黄酮，具有抑制炎症，调节细胞凋亡的作用［24］。在氧化应激下，Wang等［25］报道了金雀异黄素可降低H2O2诱导NP细胞中ROS的水平，增加Nrf2以及下游分子HO-1和NQO1的表达；而Nrf2敲除会减弱金雀异黄素的抗氧化作用。茶多酚是绿茶中的主要多酚类化合物，对多种病理疾病（包括癌症、糖尿病和心血管疾病）具有有益作用［26］。Song 等［27］研究表明，茶多酚增加Nrf2及其下游NOX4和SOD2的表达，减少ROS的产生，其抗氧化的机制是通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路发挥作用。淫羊藿苷是淫羊藿中含量最丰富的类黄酮成分，能够调控端粒和端粒酶的活性，延缓细胞的衰老［28］。Wang 等［29］发现淫羊藿苷可以减轻体内大鼠椎间盘退变，促进退变NP细胞增殖，并抑制NP细胞中炎性因子IL-1β、IL-6表达。另外，Hua等［30］通过DCFH-DA探针检测ROS的含量，H2O2刺激导致ROS的产生增加；而用淫羊藿苷预处理可以增加NP细胞中Nrf2的表达，并且减少ROS的产生。同样，萝卜硫烷是一种来自于葡甘露聚糖的异硫氰酸盐，能够靶向激活Nrf2，减少ROS的产生［31］。这些研究结果表明Nrf2是调控ROS水平的关键调控因子。

线粒体是产生ROS的主要场所，线粒体功能障碍或线粒体损伤均会导致ROS的水平异常，对细胞产生氧化损伤。其中线粒体靶向抗氧化剂Mitoqui⁃none（MitoQ）可防止线粒体氧化损伤［32］。Kang等［33］研究发现MitoQ可降低压缩诱导下的人NP细胞中线粒体ROS的产生和Keap1蛋白表达，而增加Nrf2蛋白表达；Nrf2沉默部分消除了MitoQ对抗氧化应激对细胞的损伤作用。线粒体的抗氧化剂（Mito-TEMPO）可清除细胞内的ROS。Kang等［34］研究发现Mito-TEMPO可降低H2O2诱导终板软骨细胞中线粒体ROS的升高，增加Nrf2蛋白及其靶标SOD-2、HO-1和NQO-1的表达；而Nrf2敲除导致细胞内ROS的水平增加。这些结果表明Nrf2参与线粒体功能的维持，从而减少氧化应激的损害。此外，研究表明在软骨终板细胞中，细胞自噬会影响Nrf2的表达和核易位，从而控制抗氧化蛋白的表达，保护软骨终板免受氧化应激引起的变性［35］（表1，图1）。

4.2 Nrf2在IDD中的抗炎作用

IVD细胞或巨噬细胞所分泌的促炎性细胞因子的升高与IDD的进展有关；在退化级联反应中，内部AF和NP的血管形成，使巨噬细胞迁移到IVD中，导致炎症级联反应的放大，从而加速了IDD的进程［36］。分泌的炎性介质，特别是 TNF-α、IL-1α/β、IL-6、IL-8、IL-2、IL-17、IL-10、IL-4、IFN-γ 和PGE 2，促进了细胞外基质降解、衰老和凋亡［37］。最近研究表明，Nrf2通过协调炎症细胞的募集和通过ARE调节基因表达来促进抗炎过程［38］。因此，Nrf2信号通路可能是调控炎症的重要途径。

植物来源的单体化合物，例如汉黄芩素、槲皮素、金合欢素、桑辛素及姜黄素等的抗炎作用，是通过激活Nrf2基因的表达，从而保护NP细胞免受炎症的损伤。Fang等［39］报道汉黄芩素激活大鼠NP细胞中Nrf2基因，以及SOD-2、NQO-1和HO-1基因的表达，抑制炎性介质的表达；而Nrf2的沉默进一步证实炎症介质的表达由Nrf2介导。Shao等［40］研究表明，槲皮素促进Nrf2及其下游效应蛋白HO-1的表达，抑制了IL-1β介导的NP细胞中IL-6和IL-8水平的升高。Wang等［41］发现金合欢素增加核内Nrf2蛋白以及下游HO-1、NQO1和SOD的表达，抑制THBP诱导的炎症因子iNOS和COX-2的表达。Gu等［42］用ELISA检测炎症因子的表达，结果显示LPS刺激显著增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，Nrf2和HO-1水平下调；而桑辛素处理显著增加了Nrf2和SOD的表达，减轻了炎症因子的表达；而当Nrf2基因被沉默时，桑辛素的抗炎作用被大大逆转。Cherif等［43］用免疫组化显示退化的椎间盘组织中Nrf2的表达减少；而经姜黄素预处理后，Nrf2的表达增加，ELISA显示IL-6、IL-8的表达减少。小豆蔻素通过激活Nrf2/HO-1信号轴来抑制NP细胞中IL-1β诱导的炎性因子的表达［44］。这些结果表明，Nrf2以及其下游的分子参与NP细胞炎症反应的调节。因此，Nrf2可能是参与调控NP细胞炎症反应的关键调控因子 （表1，图1）。

4.3 Nrf2改善IDD中的线粒体功能障碍

线粒体是IVD细胞中能量供应的主要来源，其通过氧化磷酸化过程产生三磷酸腺苷（Adenosine tri⁃phosphate,ATP）从而保证细胞的正常功能活动，并且也是ROS产生的贡献者［45］。线粒体自噬会清除过多的ROS以维持线粒体稳态；ROS水平过高导致线粒体功能障碍，触发程序性细胞死亡，加速IDD的进展［37-46］。Drp1从细胞质迁移到线粒体是线粒体裂变的先决条件。Kang等［33］研究发现压缩增强Drp1向线粒体的易位；用线粒体裂变阻滞剂Mdivi-1处理NP细胞，Mdivi-1显著抑制了Drp1向线粒体的易位。因此，线粒体结构的完整对于线粒体稳态和NP细胞存活至关重要。

研究证实，植物来源的单体化合物可以激活Nrf2基因，参与维持线粒体的结构与功能。线粒体中的促凋亡蛋白Cytochrome C（Cyto C）释放到细胞质中，能够促进细胞的凋亡。金线莲苷减少TBHP诱导的线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的丢失，并抑制了Cyto C的释放；而Nrf2的沉默减弱金线莲苷对线粒体的保护作用［23］。Mito⁃Tracker Green是一种绿色荧光染料，能够显示活细胞中线粒体膜电位的高低。Wang等［47］用MitoTracker Green染色显示白藜芦醇可以减轻TNF-α诱导的NP细胞荧光强度的损失和ATP生成减少，并增加核Nrf2和HO-1的水平；Nrf2敲低显示更弱的Mito⁃Tracker荧光强度，提示Nrf2在线粒体内稳态中起保护作用。Hua等［30］用JC-1染色显示线粒体的跨膜电位（ΔΨm）的强度，淫羊藿苷可以增加NP细胞中Nrf2的表达，并且降低H2O2刺激NP细胞中ΔΨm的产生，维持线粒体膜电位的稳定。

除上述研究之外，线粒体的抗氧化剂（Mito-TEMPO） 通过增加Nrf2的表达降低H2O2处理引起终板软骨细胞的ΔΨm产生，并且增加ATP的生成，减轻线粒体功能障碍［34］。这些结果表明，Nrf2可能通过改善线粒体的结构与功能进而延缓IDD的进展（表1，图1）。

图1 Nrf2作用IDD可能的机制图 多种不利因素刺激导致IVD细胞发生炎症、氧化应激和线粒体功能障碍，加速IDD的进展。Nrf2的激活剂和非编码RNA能够调控Nrf2基因及其下游分子（NQO1、SOD、HO-1和NOX4）的表达、调节自噬，发挥抗氧化、抗炎、改善线粒体功能障碍，从而延缓IDD的发展

表1 Nrf2的激活剂

5 小结

Nrf2的表达与IVD的变性程度呈负相关，并且Nrf2的表达还受到表观遗传学的调控，因此，Nrf2基因与IDD的进展密切相关。Nrf2除有上述抗氧化、抗炎、改善线粒体功能障碍的作用外，Nrf2还可通过诱导自噬蛋白p62和其他自噬相关基因的表达来促进自噬，调控氧化应激对髓核细胞的损害；很多从天然产物提取的化合物如金线莲苷、金雀异黄素、茶多酚、淫羊藿苷、汉黄芩素、槲皮素和白藜芦醇等可有效激活Nrf2，减轻氧化应激、炎症对IVD细胞的损伤，并维持线粒体的结构与功能。另外，激活Nrf2对骨关节炎、慢性肾病、糖尿病等也有一定的改善作用。目前，有关Nrf2的研究大多是通过细胞和动物实验进行的，缺乏相应的临床依据。随着对Nrf2基因不断地深入研究，有望研制出靶向Nrf2的临床药物，为IDD的预防和治疗提供新的方法和思路。