李 轲, 李 可,赵运胜, 唐慧骥,王晓晶

1. 郑州海关技术中心 (郑州 450003) 2. 浙江省检验检疫科学技术研究院 (杭州 310016) 3. 河南捷信检测认证有限公司 (郑州 450003)

即食食品( Ready-to-eat，RTE)，简称即食品，是指不需要额外加工处理，打开包装可直接入口食用的一类食品，属于非传统类食品。即食食品的种类繁多，主要包括乳酪、罐头、烘炒食品、烘焙食品、蜜饯、干果、熟肉制品等[1-2]。因其具有直接食用的特点，故对微生物限量标准的要求相对较高。而蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)主要在食物中增殖[3]，是即食食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。

虽然我国近期发布国家强制标准《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》GB 31607—2021，仅对以米为主要原料制作的即食食品中蜡样芽孢杆菌进行了限量规定[4]，但其他原料制作的即食食品蜡样芽孢杆菌的检出率也居高不下，据食品伙伴网讯，全球发生因蜡样芽孢杆菌污染即食食品被召回事件2020年8起，2021年11起，涉及的即时食品主要包括拉米香肠、意大利面条和意大利熏火腿、熏制三文鱼、烤鸡胸片、鲱鱼罐头、馅饼和软奶酪、黄油产品、生乳乳酪、花生酱等，涉及国家大多分布在北美洲、西欧等发达国家，这些国家和我国跨境贸易来往密切，对此，我国国门生物安全提示高度预警。

目前，即食食品中蜡样芽孢杆菌的检测主要依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》GB 4789.14—2014[5]，此种方法步骤繁琐复杂，检测周期需要5～7 d，培养基使用多(17种)，除需要使用多种标准菌株以外还需要进行溶血试验、动力试验、溶菌酶耐性试验、蛋白质毒素结晶试验等复杂耗时的生化实验。这些实验对实验人员的经验、操作、环境及试剂的质量要求较高，影响结果因素较多，这些不确定因素给病原菌的分离鉴定工作带来了一定的困难，使得检验人员容易出现误判。同时，在食品中经常遇到多种病原菌混合存在的情况，更增加了检测工作的难度，使得结果准确性无法保证。实时光电检测技术是一种以传统经典方法为理论基础的自动检测技术，该技术实时快速、操作简单、简化了传统微生物的检测方法，人为误差引入少，可明显缩短检测时间[6]，是一种理想的食品快速检测技术。

因此，本研究探索建立了基于实时光电技术的即时食品蜡样芽孢杆菌快速检测曲线模型并进行了验证，实验设计检测数据在1×106～9.5×106CFU/mL之间，实验结果检出时间(Detection Time，DT)范围在5.28～28.31 h之间，符合即时食品限量及快检要求。应用该技术预期可提高对即食食品中蜡样芽孢杆菌的监测、溯源、鉴定、预警和控制能力，对保障我国食品安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品

市购各类即食食品24份(奶酪1份、干酪1份、奶片1份、生牛乳1份、奶油1份、香肠1份、熏火腿1份、烤鱼片1份、熏制三文鱼1份、熟肉丸1份、泡椒凤爪1份、豆干1份、素鸡条1份、豆乳1份、芒果干1份、黄瓜条1份、萝卜干1份、黄桃罐头1份、香菇脆1份、小米锅巴1份、饼干1份、卤蛋1份、米果1份、即食米片1份)。

1.1.2试剂

蜡样芽孢杆菌检测管，纽勤生物科技(上海)有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤、甘露醇卵黄多黏菌素琼脂(MYP)、营养琼脂、蜡样芽孢杆菌干制生化试剂盒，北京陆桥公司。

1.1.3标准菌株

蜡样芽孢杆菌标准菌株(CICC10041、CMCC63301-15)，郑州海关技术中心生物实验室保存。

1.1.4仪器设备

微生物快速检测仪(S128)，美国Neogen；恒温培养箱(INE500)，德国美墨尔特；电子天平(PL601-L)，梅特勒-托利多；拍击式均质器(Masticator)，西班牙IUL；生物安全柜(1379)，美国赛默飞；移液器(0.1～1 mL)，德国eppendorf；麦氏比浊管，北京天安联合科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1标准菌液制备

取冻存蜡样芽孢杆菌标准菌株(CICC10041、CMCC63301-15)各1支，接种100 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉汤，30 ℃培养50 h；生物安全柜内操作，将培养后的菌液10倍递增稀释至107倍，保存不同浓度菌液备用。

1.2.2样品基础检测情况

无菌条件下按GB 4789.14方法检测对1.1.1各样品进行蜡样芽孢杆菌检测，结果1份样品疑似阳性，单独保存，其余阴性样品留作本试验备用。

1.2.3人工污染样制备

无菌条件下称取1.2.2样本各25 g，分别放入装有225 mL PBS无菌均质袋内，混匀，随机编号为1、2、3……25，每个样品平行制作3份，共3组，备用。

取1.2.1原液菌液用麦氏比浊管法校正两种菌液浓度均约为3.0×108CFU/mL。接种第1组样品，每个样品接种1 mL，1～10号接种CICC10041菌液，11～24号接种CMCC63301-15菌液；同样操作取103倍稀释菌液接种第2组样品；106倍稀释菌液接种第3组样品。均质，备用。

1.2.4标准曲线建立技术原理

实时光电检测技术是以传统微生物培养理论、染色技术为基础[7]，将新光源和光子探测技术、二氧化碳传感技术结合在一起，通过双温光电检测系统和计算机控制的模块化分析系统来监控微生物生长代谢所引发的光密度和颜色的变化[8]，当目标微生物在特异性的检测瓶中生长，代谢产物二氧化碳引起含有颜色指示剂的传感器颜色变化[9]，检测瓶颜色变化所需时间与样本中微生物含量成反比[10]，即微生物含量越多，变色所需时间越短；微生物含量越少，颜色变化需要的时间越长[11]。

1.2.5标准曲线建立

取蜡样芽孢杆菌标准菌株(CICC10041)原液及相邻10倍递增稀释菌液各1 mL，按照GB 4789.14 4.2.4分别接种MYP平板，30 ℃培养48 h，计数结果；同时移取0.1 mL菌液原液加入蜡样芽孢杆菌检测管，将检测管拧紧混匀，上机检测，依据GB 4789.14设定条件30 ℃、48 h，每个稀释度平行测试5次，获得35组数据，以传统方法的计数结果(CFU/mL)的对数值为纵坐标，以实时光电法相应稀释度的DT值为横坐标，建立平板计数和DT值之间的对应关系，剔除偏差较大数据，生成标准曲线图，用于蜡样芽孢杆菌的定量检测。

1.2.6标准曲线验证

取1.2.3第2组样本1～25号，依据GB 4789.14检测，得到计数结果；同时各移取0.1 mL加入蜡样芽孢杆菌检测管中，设定仪器参数30 ℃、48 h，仪器自动记录各样本的DT值，将DT值代入标准曲线中得到相应样本的蜡样芽孢杆菌数；获得的2组数据进行统计学分析。

1.2.7方法稳定性验证

取1.2.3中所有组样本，使用实时光电法进行检测，得到的结果组内求相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)，分析其稳定性。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线建立

根据国标法平板计数结果，菌液的蜡样芽孢杆菌含量为5.6×108CFU/mL，将菌液进行7次10倍递增稀释，每个稀释度进行2种方法5次重复测定，获得35组一一对应的数据制作标准曲线如图1，标准曲线方程为y(lgCFU/mL)=-0.259 6x+7.349 7,相关系数R2=0.940 3.表明实时光电法检出时的DT值和蜡样芽孢杆菌含量的对数呈较强的负相关性。实时光电检测技术是通过光电技术实时监测微生物的代谢产物，样品中微生物含量越高，代谢产物积累到仪器感应剂量时间越短，反之亦然[12]，因此，可以利用该标准曲线检测样品中蜡样芽孢杆菌污染程度。

图1 蜡样芽孢杆菌检测标准曲线图

2.2 标准曲线验证

选取高浓度菌液人工污染的第1组1～24号及25号样本，采用实时光电法检测，得出各样品对应的DT值，同时GB 4789.14进行蜡样芽孢杆菌测定，测定结果见表1。剔除25号结果数据，对其余不同方法不同条件下获得的两组结果选择多种统计方法进行组内、间差异性分析，结果见表2。

依据ISO 4833-1:2013 《Microbiology of the food chain -Horizontal method for the enumeration of microorganisms-Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique》[13]，复现性限值R=0.45，表1结果符合率96%，标准曲线可信。表2数据分析结果，两组数据组内RSD值均小于5%，表明组内数据稳定，标准曲线有效；组间数据单因素方差分析，当a=0.05时，F crit(临界值)=4.05，F(检验统计量)=0.40，P-value(观测到的显著水平)=0.53，结果显示F

表1 蜡样芽孢杆菌标准曲线验证结果

表2 统计分析表

2.3 稳定性验证

选取1.2.3中高、中、低浓度污染的3组样品进行稳定性试验。测试结果见表3。3组样品测试结果RSD值分别为3.7%、1.78%、4.80%，均低于5%。表明实时光电法测试即时食品蜡样芽孢杆菌不受样品基质种类限制，具有良好的稳定性。

表3 蜡样芽孢杆菌稳定性试验结果

3 结束语

(1)本研究选取不同基质的样本进行高浓度菌液污染后进行了标准曲线的验证及稳定性验证。试验过程发现同一样本两种方法检测，国标法结果稍低，推测可能是光电法采用的是指示剂变色原理，利用光子探测技术对传感器因颜色变化导致的透光度的变化实时监测，自动探测较人工观察稍灵敏。

(2)试验过程发现不同基质的样本检测结果稳定，RSD值符合要求，实时光电法检测结果不受基质干扰，方法具有良好的特异性和灵敏性，与张翠芬[14]的研究结论一致。

(3)本研究前期探索时为避免假阴性出现，把仪器时间参数设定为48 h，试验过程发现，低浓度污染的样本30 h以内均能实现个位数结果检出，因此在实际应用过程中可设定时间参数为30 h；依据GB 31607—2021，以米为主要原料制作的即食食品中蜡样芽孢杆菌限量规定≤10 000 CFU/g(mL)，直接根据限量值，利用标准曲线计算样本的检测时间为12.90 h，在检测以米为主要原料制作的即食食品时可直接设定时间参数为13 h，以提高检测效率；

(4)样本计数范围达到覆盖5～6 个指数级时，制作标准曲线时的2 种方法相关性越可靠[15]，因此，本试验探索使用7个10倍梯度稀释菌液建立标准曲线，验证标准曲线及稳定性时使用了两株不同来源的标准菌株(CICC10041、MCC63301-15)，结果表明，该标准曲线准确、可靠，覆盖面广而具有代表性。

(5) 由于即时食品种类繁多，受防腐剂、色素、抑菌成分、生产环境、存放条件等的影响，污染的蜡样芽孢杆菌来源复杂，标准曲线的适用性有一定的局限，实际工作中需要不定期对标准曲线进行校正和验证，以提高标准曲线的适用性、准确性、重复性[16]。

(6)受研究时间限制，本实验仅收集到1份自然污染样本，利用标曲模型和国标法测定后，两种方法得出结果相吻合。后续研究可更多关注即时食品蜡样芽孢杆菌污染情况，以期收集更多自然污染样品，完善检测模型。

综上，实时光电法蜡样芽孢杆菌标曲模型的建立基于两种方法科学的结合，因此实时光电法和GB 4789.14传统方法具有极好的一致性，且操作简单，应用方便，检测时间缩短明显，好用，实用，适宜在口岸跨境电商即时食品监测、生产企业卫生监控、产品质量控制等场所推广应用。