刘永斌 王成 刘延杰 刘芳 岳萌 吕菲 刘广杰 王贵英

Transcobalamin 1(TCN1)是一种维生素B12(钴胺素)转运蛋白，参与体内钴胺素的转运和代谢。有研究显示，TCN1在多种肿瘤病人的血液和肿瘤组织中高表达。生物信息学分析发现，TCN1在多种实体癌组织中高表达，并且与肿瘤侵袭性生物学行为和不良预后有关[1]。本研究拟探讨结直肠癌(colorectal cancer,CRC)病人原发肿瘤、肺转移瘤及配对正常组织中TCN1的表达状况，分析CRC病人肿瘤组织中TCN1表达水平与病人临床特点、以及化疗敏感性的相关性。

对象与方法

一、对象

2009年5月～2019年1月我院收治的CRC肺转移病人42例。男性29例，女性13例。年龄<60岁19例，≥60岁23例。根据2003年修改的国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合会(AJCC)联合制订的TNM分期法进行分期：CRC浸润深度T1 0例,T2 2例,T3 4例,T4 36例。N0 20例，N1 13例，N2 9例，其中Ⅰ期2例，Ⅱ期14例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例。非同期发现CRC肺转移病人32例，其中CRC术前接受新辅助化疗病人19例，未行术前新辅助治疗病人13例。同期转移10例。见表1。

二、方法

1.信息收集：包括性别、年龄、TNM分期、肺转移癌直径大小、是否接受新辅助(奥沙利铂加氟尿嘧啶类)化疗、TCN1表达水平及病人生存状况。

2.病理组织信息：包括结肠镜活检组织、手术中获得的CRC及癌旁正常黏膜组织、肺转移癌组织及配对正常肺组织。

3.苏木-曙红(HE)染色和免疫组织化学(immunohistochemical，IHC)：HE染色用于诊断，IHC用于检测TCN1在不同组织中的表达。TCN1多克隆抗体购于ABclonal公司。阳性肿瘤细胞比例及染色强度分别赋分计算，最终IHC得分以两者计分乘积计算。组织染色方法为HE染色。评价标准：染色阳性的肿瘤细胞比例赋分为:0(无肿瘤细胞染色)、1(肿瘤细胞显色数<25%)、2(肿瘤细胞显色数25%～50%)、3(肿瘤细胞显色数50%～75%)、4(肿瘤细胞显色数75%～100%)。染色强度分级赋分按3(棕=强染色)、2(黄棕色=中度染色)、1(淡黄色=弱染色)、0(无染色)进行评价。最终表达水平得分数等于肿瘤细胞显色比例和染色强度得分乘积。评分0～2分视为TCN1阴性表达，3分以上为TCN1阳性表达，将表达水平得分<6判定为低表达组，评分≥6分判定为高表达组。所有病理切片均隐去病人临床资料，由两名经验丰富的病理科医师独立进行读片。结果不一致时以染色较低的分数计，避免人为造成过度判断所致的假阳性。

三、统计分析

应用SPSS 21.0软件分析数据，CRC组织与癌旁组织、配对肺转移组织与正常肺组织之间的TCN1表达差异，TCN1表达与临床病理的特征之间的相关性使用χ2检验或Fisher检验。化疗前后及结肠镜活检组织与术后标本中TCN1表达情况应用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.TCN1表达与CRC组织、肺转移组织临床病理特征的关系见表1。结果表明，CRC组织中TCN1表达与淋巴结转移、TNM分期显著相关。与病人性别、年龄、肿物侵犯深度无明显相关性。见表2。肺转移组织中TCN1表达强弱在性别、年龄、转移瘤大小间差异均无统计学意义。

表1 CRC组织中TCN1表达与病人临床病理特征的关系(例)

表2 CRC肺转移组织中TCN1表达状况(例)

2.TCN1在CRC组织、肺转移癌组织及癌旁组织的表达情况：对42例CRC及配对的癌旁组织进行HE染色和IHC。HE染色用于诊断，IHC用于检测TCN1在不同组织中的表达，组织染色阳性代表图(图1)。在42例CRC组织中高表达23例(54.7%，23/42)，阳性表达率为76.1%(32/42)，配对的癌旁正常黏膜组织高表达0例，阳性表达率为9.5%(4/42)。相应的42例CRC肺转移癌组织中，肺转移癌组织高表达25例(59.5%，25/42)，阳性表达率为83.3%(35/42)，其配对的肺正常组织，高表达0例，阳性表达率为4.7%(2/42)，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。但在CRC组织与肺转移性肿瘤组织中，CRC组织与肺转移癌组织中TCN1表达水平相似，二者间TCN1表达水平比较差异无统计学意义(图2a)。

A.正常结肠组织(HE×100)；B.TCN1在结肠癌组织中低表达(sp，x400)；C.TCN1在结肠癌组织中高表达(sp，x400)；D.正常肺组织切片(HE×100)；E.TCN1在结直肠癌肺转移组织中低表达(sp，x400)；F.TCN1在结直肠癌肺转移组织中高表达(sp，x400)

表3 TCN1在癌组织和癌旁组织中表达情况比较(例)

a.CRC与CRC肺转移癌组织；b.新辅助化疗前后CRC组织；c.结肠镜活检标本与手术标本组织图2 不同组织中TCN1表达水平比较

3.化疗前后及结肠镜活检组织与手术切除组织中TCN1表达情况：本组42例病人中，32例为非同期发现CRC肺转移病人，其中19例在行CRC切除术前进行了奥沙利铂加氟尿嘧啶类化疗药物新辅助化疗，13例病人未行术前化疗。行新辅助化疗组的CRC转移中位时间为32个月(10～74个月,95%CI:27.0512～47.2646)；未行化疗组CRC转移中位时间为20个月(8～44个月；95%CI:16.2942～47.2646)。两组转移时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。19例新辅助化疗病人化疗前结肠镜活检组织与化疗后手术切除肿瘤组织中免疫组化得分由新辅助化疗前(4.05±2.24)分降低为(2.47±2.0)分，两者比较差异有统计学意义(P<0.05，图2b)。结肠镜活检组织标本TCN1免疫组化表达水平为(4.38±2.35)。23例未行化疗的病人手术切除组织中TCN1表达水平为(4.65±2.46)，两者相比,差异无统计学意义(P>0.05，图2c)。

讨论

现阶段结直肠癌病人微卫星不稳定性、KRAS、BRAF、HER-2等检测为个体化治疗提供了分子基础[2]。临床上也在积极探索CRC治疗疗效评价和治疗耐药监测。从循环肿瘤细胞到蛋白，从mRNA、lncRNA、cirRNA到外泌体以及基因位点突变，在各个领域不断探索，以期找到敏感指标，评价治疗效果[3]。

尽管对于CRC的治疗有重大进展，许多CRC病人仍旧无法逃脱远处转移和复发的命运，特别是CRC肺转移病例数的不断增加，严重影响病人长期预后。另一方面，CRC病人化疗敏感性评价也缺乏敏感指标。因此，临床上不断致力于寻找新的预测性生物标志物，用于CRC进展和转移的早期监测。

TCN1是一种Cobalamin(Vitamin B12)转运蛋白，可将钴胺素从胃运输到肠道。它主要存在于细胞质中，并与TCN2和内在因子在VitB12的运输，代谢和维持体内VitB12平衡过程中发挥的作用，尤其是在维持造血和神经系统功能方面意义重大[4-5]。有研究发现，人类多种癌症病人血清中维生素B12和TCN1表达水平异常，高浓度钴胺素和TCN1与白血病、肝细胞癌和乳腺肿瘤的叶状细胞有关，在某些实体瘤中已检测到TCN1的上调[6-7]。TCN1可以通过TCN1表达水平来区分乳腺分界和恶性肿瘤与乳腺叶状肿瘤，肿瘤组织中高水平的TCN1与肿瘤的发生和不良的生物学行为有关[8]。有研究显示，TCN1可能是下咽鳞状细胞癌和接受化疗的直肠癌的一种新型不良预后生物学标志物。研究发现，TCN1是CRC中是排名靠前的差异表达基因[4,8]。生物信息学数据挖掘也发现TCN1是一种原癌基因，可用于区分正常结直肠组织和CRC[4]，有证据表明TCN1参与了众多肿瘤的发生和发展[3]。

本研究结果证实TCN1在CRC组织中呈高表达，其表达水平随肿瘤恶性生物学行为相关，随分期增加逐渐升高。TCN1在肺转移癌组织中也呈现高表达状态，其表达水平与原发性CRC的表达水平一致。 因此，我们推测TCN1在CRC的进展和转移中发挥了潜在作用。Lee等[6]发现，TCN1在直肠癌中过表达，其表达水平与晚期肿瘤治疗、淋巴结状态、血管浸润和肿瘤消退等级有关。 Wu等[9]报道，TCN1在胰腺癌中高表达，与我们的研究结论一致。

有研究表明，TCN1与新辅助化疗和同步放化疗敏感性相关，并预测TCN1可能是监测耐药性的潜在生物标志物[6-7]。Lee等[6]用TCN1评价新辅助化疗的敏感性，发现TCN1表达水平与治疗疗效和肿瘤消退分级相关。敏感的生物标志物可以用于筛选化疗药物，评价治疗疗效。本研究发现，CRC病人肠镜活检组织与术后标本的TCN1表达水平一致，说明可以利用肠镜活检组织代替手术标本用于TCN1检测。

CRC病人应用奥沙利铂加氟尿嘧啶新辅助化疗后CRC组织TCN1表达水平下降，说明抗肿瘤药物会影响组织中TCN1的表达。因此，这部分研究提示TCN1有可能作为筛选敏感化疗药物的生物标志物。但有必要扩大样本量及进一步进行前瞻性实验，以验证该结果并确定TCN1表达变化与预后之间的关系。