王凯娟，朱 琦，丁 丁，张 弨，曹云霞，陈蓓丽，章志国

卵巢储备功能低下(decreasing ovarian reserve, DOR)是指女性卵巢内储备的卵泡数目减少，排出的卵子质量下降，导致患者生育功能减退，常伴有基础卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)水平降低以及窦卵泡数目(antral follicle count，AFC)减少[1]。DOR患者临床上常表现为月经周期不规律、经量减少、闭经和不孕等。该类患者在辅助生殖技术助孕过程中常面临获卵数少，周期取消率高的困境，让临床医师和胚胎学家非常棘手。研究[2-3]报道DOR可能与氧化应激损伤有关，而褪黑素(melatonin，MT)有强大的抗氧化性，研究[4]显示将MT添加至小鼠的体外培养液中能明显提高其囊胚形成率。该研究探讨了在胚胎培养液中添加MT是否可以改善DOR患者辅助生殖治疗过程中的胚胎发育情况及最终的临床结局。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2020年8—11月于安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心进行体外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transfer, IVF-ET)的DOR患者128例，通过掷硬币方式将其随机分为褪黑素组(n=56)和对照组(n=72)。进一步对采取IVF和ICSI方案的褪黑素组和对照组患者进行分组，分为采取IVF方案的褪黑素A1组患者(n=37)和对照B1组患者(n=52)，采取ICSI方案的褪黑素A2组患者(n=19)和对照B2组患者(n=20)。根据本课题组之前的研究[5-6]结果，添加10-9mol/L的MT(美国Sigma公司)可以改善未成熟卵子的后期发育质量，该研究在褪黑素组的胚胎培养液中添加该浓度的MT。两组患者的一般临床资料如年龄、基础FSH值、体重指数(body mass index, BMI)及患者的不孕类型等基本资料差异均无统计学意义，见表1。收集标准：基础FSH水平>10 IU/L；AMH值<1.11 μg/L；卵泡早期经阴道B超提示双侧窦卵数≤7个，满足上述其中两条即可[1]。排除患者双方染色体检查异常、复发性流产、子宫内膜异位症、子宫腺肌症及排除男方严重少弱精子症引起的不孕症等。

表1 DOR患者的基本临床资料

1.2 控制性促排卵方案月经来潮第2～4天根据性激素水平和卵巢情况启动促性腺激素释放激素拮抗剂(gonadotropin releasing hormone antagonist, GnRH-ant)方案(丽申宝、HMG或果纳芬)，药物使用5 d后开始监测卵泡发育情况。当≥3个主导卵泡直径达18 mm，平均每成熟卵泡E2水平为200～300 ng/L，注射hCG(5 000～10 000)IU或rhCG 250 μg，36 h后B超引导下行阴道穿刺取卵术。

1.3 胚胎培养取卵后根据精子质量行常规体外受精(invitrofertilization, IVF)或卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)受精，IVF受精后5 h拆除卵周颗粒细胞，在倒置显微镜下观察卵母细胞是否排出第二极体以确认受精，若受精将其移至卵裂期培养液(澳大利亚COOK公司)中(褪黑素组于卵裂期培养液添加MT)；ICSI受精后立即移至卵裂期培养液中(褪黑素组于卵裂期培养液添加MT)，置于37 ℃培养箱中继续培养。所有卵裂期胚胎均在受精后第3天移至囊胚期培养液(澳大利亚COOK公司)中(褪黑素组置于囊胚期培养液添加MT)，受精第5～6天观察囊胚形成情况，囊胚期胚胎评分标准参照Garnder囊胚分级法。

1.4 胚胎冷冻及解冻胚胎评分第5天(D5)囊胚等级大于等于3BC和第6天囊胚等级(D6)大于等于4BC者可冷冻。取卵术后第2次或第3次月经来潮后可准备移植冷冻胚胎。

1.5 胚胎移植该研究纳入的所有患者均选择冻融周期进行胚胎移植，当患者子宫内膜厚度≥8 mm且形态较好时，肌注黄体酮或人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)，数天后行胚胎移植。移植后继续予以黄体支持，移植第14天检测血或尿hCG值，若为阳性则继续支持治疗。并于移植后第28～30天行阴道超声检查宫腔内有无孕囊以明确临床妊娠的诊断。

1.6 统计指标比较两组间卵子成熟率、受精率、卵裂率、第3天(D3)优质胚胎率、囊胚形成率、优质囊胚率、囊胚种植率及临床妊娠率是否存在差异。

2 结果

2.1 褪黑素组与对照组的胚胎发育情况及临床结局比较两组的卵子成熟率、受精率和卵裂率，差异无统计学意义，但褪黑素组的D3优质胚胎率、囊胚形成率及优质囊胚率均较对照组增高，且差异有统计学意义；褪黑素组获得优质囊胚的周期占比数较对照组高，且差异有统计学意义。见表2。已移植周期中褪黑素组(n=31)和对照组(n=50)的着床率和临床妊娠率差异均无统计学意义(目前未出现流产情况)。见表3。

表2 DOR患者卵子的成熟、受精及胚胎早期发育状况[%(n/N)]

表3 DOR患者移植后的妊娠结局[%(n/N)]

2.2 采取IVF方案的褪黑素组和对照组患者的卵子受精及胚胎早期发育结果A1组和B1组的受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义，A1组D3优质胚胎率和优质囊胚率均较B1组高，且差异有统计学意义。见表4。

表4 褪黑素组和对照组IVF患者受精及胚胎早期发育状况比较[%(n/N)]

2.3 采取ICSI方案的褪黑素组和对照组患者的卵子受精及胚胎早期发育结果A2组和B2组的受精率、D3优质胚胎率、囊胚率和优质囊胚率差异均无统计学意义，A2组卵裂率较B2组低，且差异有统计学意义。见表5。

表5 褪黑素组和对照组ICSI患者受精及胚胎早期发育状况比较[%(n/N)]

3 讨论

卵巢储备功能减退是一个渐进的过程，早期DOR若未及时诊治，可能进一步发展到早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)，甚至卵巢早衰[7]。在该研究中，通过在DOR患者的胚胎培养液中添加MT，观察其胚胎发育情况及临床治疗结局以了解MT是否能改善胚胎发育。

IVF方案两组患者的受精率、卵裂率、囊胚形成率的差异均无统计学意义，但A1组D3优质胚胎率和优质囊胚率均高于B1组，且差异有统计学意义。另外，ICSI方案两组患者的受精率、D3优质胚胎率、囊胚形成率和优质囊胚率的差异均无统计学意义，但卵裂率差异有统计学意义。以上结果表明，在精子质量有保障的前提下，MT可以提高卵子发育潜力，改善胚胎发育质量。

胚胎质量是影响胚胎着床的决定性因素之一，获得更多优质囊胚的DOR患者受孕概率增加[12-13]。Asgari et al[14]在小鼠胚胎培养液中分别添加10和100 nmol/L的MT，卵裂率、囊胚的总细胞数及胚胎植入均有显著改善。Tamura et al[15]在2020年发表的系统性综述中分析了13份动物培养液中添加MT的实验报导，5份关于人类不孕症和1份关于DOR患者口服MT的病例报导，结果显示MT能改善动物卵母细胞的质量和胚胎发育，并促进不孕症患者卵子成熟及提高胚胎质量。但褪黑素组所获得优质囊胚的周期数较对照组高，且差异有统计学意义(P<0.05)。目前对于人类胚胎培养液中直接添加MT的研究尚少，该研究的结果证明了在胚胎培养液中添加MT能够促进DOR患者的胚胎发育，获得更多的优质胚胎，从而为DOR患者的生育力改善提供更多的保证。该研究中，褪黑素组和对照组的着床率和临床妊娠率差异均无统计学意义，说明两组优质囊胚质量是相当的。因此，改善DOR患者临床结局的关键就是尽可能获得更多优质囊胚。该研究结果显示褪黑素组所获优质囊胚的周期占比数较对照组高，且差异有统计学意义，这说明MT应用于早期胚胎的体外培养能提高DOR患者卵子的发育潜力，使更多治疗周期获得优质囊胚，进而改善DOR患者的治疗效果。

综上所述，MT应用于早期胚胎的体外培养在一定程度上能促进DOR患者卵子的发育，提高胚胎质量，改善DOR患者的治疗效果，为DOR患者的临床治疗提供了一种新思路，具有重要的临床应用价值。