蓝永锋，刘冰，曾诚

（1.北京同仁堂广州药业连锁有限公司，广东 广州 510070；2.广东药科大学药学院，广东 广州 510006；3.广东药科大学新药研发中心，广东 广州 510006）

阿霉素（doxorubicin，Dox）是目前临床上高效、广谱的抗肿瘤化疗药物之一，可用于治疗成人和儿童的实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤[1]。但Dox的长期使用会出现一系列不良反应，特别是引起时间及剂量依赖性的心脏毒性，限制其在临床上的应用。Dox诱发的心脏毒性通常导致不可逆的心肌损伤，使患者发生充血性心力衰竭，甚至死亡[1]。因此，亟待新的有效药物治疗Dox的心脏毒性，将有助于扩宽Dox的适用人群。

Dox引起的心肌损伤呈剂量相关性，伴有心肌细胞死亡，但其心脏毒性机制至今仍未完全明确。研究显示，Dox可激活Toll样受体/NF‑κB信号通路，诱导炎症因子如白细胞介素（interleukin,ⅠL）‑1释放，导致心肌细胞的坏死和凋亡[2‑3]。相反，抑制炎症反应的发生可显著减轻Dox所致的心肌损伤。

丁苯酞（3‑N‑butylphthalide,NBP），分子式为3‑丁基‑1（3H）‑异苯并呋喃酮（3‑butyl‑1（3H）‑isoben‐zofuranone），是从天然食用植物芹菜籽中提取的有效成分为油状液体，具有芹菜香味，为我国自主研发的一类新药。研究显示，NBP有软胶囊和注射液2种制剂，具有保护线粒体功能、抗氧化应激、调节细胞凋亡与自噬等药理作用，并由于其脂溶性高，易于通过血脑屏障，可直接作用于梗死部位，具有起效迅速和效果显著的特点，已经成为临床上治疗急性缺血性脑卒中的首选药物[4]。除缺血性脑卒中外，NBP能改善包括自身免疫性脑脊髓炎在内的多种炎症相关类疾病[5‑6]。此外，NBP对心肌缺血性再灌注损伤和异丙肾上腺素引起的慢性心衰均具有一定的保护和预防作用[7‑8]，提示NBP在临床上可用于治疗炎症相关的心肌疾病。然而，尚未见NBP保护Dox所致心肌毒性的报道。

本研究旨在探索NBP能否改善Dox所致的心肌毒性及其可能的机制，为Dox心脏毒性的预防和治疗提供科学实验依据，也可为NBP临床新适应证的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物

大鼠心肌细胞系H9C2细胞来源于中国科学院上海细胞库；SPF级雄性C57BL/6小鼠，6~8周龄，体质量18~22 g，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2018‑0002。动物质量合格证号：44007200084001。动物实验得到广东药科大学实验动物管理与使用委员会批准，批准号：gdpu‐lacspf2017335。

1.2 药物与试剂

NBP购自美国MCE有限公司；阿霉素（CAS号：25316‑40‑9）购自美国selleck公司；南美胎牛血清（批号：2243863）、DMEM培养基（批号：8120373）、胰酶（批号：25200072）购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液（PBS；批号：PM291317160）购自Coolaber公司；ECL发光液（批号：BL523A）购自Biosharp公司；NLRP3（批号：A6345）、Caspase‑1（批号：A0964）抗 体 购 自ABclonal公 司；β‑actin（批 号：GTX 109639）、二抗山羊抗兔ⅠgG（批号：GTX213110‑01）购自美国Gene Tex公司；BCA蛋白定量试剂盒（批号：SK258367）购自美国Thermo Scientific公司。

1.3 主要仪器

SW‑CJ‑1FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；HF151UV型CO2培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；AFC2型流式细胞仪、1510型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Microfugu20R型高速冷冻离心机、Allegra X‑12R型大型离心机（美国Beckman Coulter公司）；3300 Mini型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；2100型超声检测仪（加拿大VⅠVO公司）；ME204E型电子天平（美国METTLER TOLEDO公司）。

1.4 分组与给药

将32只C57BL/6雄性小鼠，随机分成4组，每组8只，即正常组、NBP组、Dox组、治疗组（Dox+NBP组）。Dox组和治疗组小鼠腹腔注射Dox 4 mg/kg，正常组及NBP组腹腔给予等体积PBS缓冲液，每周1次，共注射3周，累积量为12 mg/kg[9]。3周后，NBP溶于3%（W/V）的吐温‑80中，治疗组腹腔注射NBP 40 mg/kg，按体质量调整给药量，同时NBP组给予相同剂量的NBP，模型组和正常组给予相同剂量的溶剂（吐温‑80），每天1次，连续给药3周。

1.5 蛋白免疫印迹法分析各组的蛋白表达量

采用RⅠPA裂解液提取心肌组织和H9C2细胞总蛋白，用BCA法定量检测浓度之后，取等量蛋白提取液，进行SDS‑PAGE凝胶电泳实验对蛋白进行分离，电泳完成后，通过Bio‑rad电转仪将电泳产物转移至PVDF膜上，取膜并用脱脂奶粉封闭1 h后，将PVDF膜在一抗中4℃孵育过夜，洗膜后加入相应二抗37℃孵育1 h，使用ECL在凝胶成像系统进行曝光。

1.6 超声检测仪检测各组小鼠心功能

初次给予Dox后的第6周，对各组小鼠进行心脏超声检查。腹腔注射2%（ρ）戊巴比妥钠，待小鼠处于麻醉状态后，固定在恒温板上，胸部脱毛，应用心脏超声检测仪，对各组小鼠进行心脏超声心动图检查，观察小鼠心功能变化。所有超声心动检查均通过连续检测3个心动周期，取各组检测值的平均值。

1.7 小鼠心脏取材及心脏质量与体质量比值（heart weight/body weight，HW/BW）

实验结束后对各组小鼠进行称重，0.3%戊巴比妥钠按照10~20 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉、固定小鼠，按顺序解剖组织进入胸腔，心尖微向左旁开3~4 mm处插入磨钝的一次性静脉注射器，注入少量冷的PBS充盈心脏后剪开右心耳，匀速推入PBS进行灌注，待肝肾组织由深红色变为浅红色后，随后小心地分离和称量心脏质量，心肌从最大横切面分离成两部分，其中一部分放入冻存管并置于-80℃保存。另外一部分放入4%（φ）的多聚甲醛中固定组织样品。通过过量麻醉对动物实施安乐死，最后记录各组小鼠心脏质量与体质量比值。

1.8 HE染色

将取出的心脏组织固定于4%多聚甲醛24 h，脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，使用苏木素和伊红对组织进行染色，用中性树胶对切片封片，在光镜下以不同的视野在相同的设置下观察心脏组织的病理学改变。

1.9 Masson染色

将取出的心脏组织固定于4%多聚甲醛24 h，常规脱水，石蜡包埋，切片，按照Masson复合染液说明书进行染色，以95%（φ）乙醇与无水乙醇展开脱水处理后，以二甲苯予以透明，待其干透前滴加中性树胶，确保切片充分浸泡，使用中性树胶封片，待风干后镜下观察。

1.10 MTT法检测细胞存活率

将H9C2细胞消化并计数，以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，细胞贴壁后，用不同浓度药物处理细胞24 h。药物干预结束后，每孔中加入180μL无血清培养基和20μL MTT溶液，在37℃下避光孵育4 h。除去上清液，每孔加入150μL DMSO，轻轻摇晃，最后使用酶标仪在570 nm下测量吸光度。细胞存活率=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

1.11 细胞培养与分组

H9C2细胞培养于10%（φ）胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、体积分数为5%（φ）的CO2标准加湿培养箱中培养。NBP溶于DMSO中配制成质量浓度为50 mg/L的母液，临用前用DMEM培养基配制成相应的浓度。细胞实验分组：正常组、NBP组（50μg/mL）、Dox组（5μmol/L Dox）、治疗组（Dox+NBP）。细胞经过相应药物处理24 h后，利用蛋白免疫印迹法分析NLRP3炎症小体相关蛋白表达量。

1.12 统计学方法

采用GraphPad Prism 7统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，当数据满足正态分布和方差齐性时，两两比较用LSD‑t检验，当数据不满足正态分布或方差齐性时，两两比较用Dunnett’s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NBP对Dox所致小鼠心功能障碍的影响

如图1所示，与正常组比较，Dox组小鼠左心室收缩末期内径（left ventricular end‑systolic diameter,LVESD）和左心室舒张末期内径（left ventricular end‑diastolic diameter,LVEDD）明显增大（P＜0.05），并伴随收缩功能参数心脏射血分数（ejection fraction,EF）和短轴缩短率分数（fractional shortening,FS）、HW/BW明显降低（P＜0.05）。与正常组比较，NBP组上述心功能指标差异无统计学意义（P＞0.05）。与Dox组比较，治疗组小鼠LVEDD、LVESD、EF、FS和HW/BW等反映心脏功能指标均明显改善（P＜0.05）。

图1 NBP对Dox诱导的小鼠心功能的影响Figure 1 The effect of NBPon heart function induced by Dox in mice(±s,n=8)

2.2 NBP对Dox所致的小鼠心肌损伤的影响

如图2所示，正常组和NBP组小鼠心肌结构正常，纤维排列规则整齐，细胞核居中，胞浆纹理清晰，未见心肌纤维化表现；Dox组小鼠心肌纤维排列紊乱、肌丝断裂，Masson染色可见大量蓝色胶原纤维，心肌纤维化明显。与Dox组比较，治疗组小鼠心肌病变较轻，心肌纤维密度较高，可见纤维排列稍微紊乱、细胞形态大体完整，蓝色胶原纤维也较Dox组少。上述实验结果表明，NBP可减轻Dox引起的小鼠心肌病变。

图2 丁苯酞对阿霉素诱导的小鼠心肌损伤的影响（心脏组织HE染色和Masson染色，400×）Figure 2 The effects of NBPon myocardial injury induced by Dox in mice(HEstaining and Masson staining,400×)

2.3 NBP对Dox所致小鼠心肌NLRP3炎症小体相关蛋白的影响

如图3所示，与正常组比较，Dox组小鼠心肌NLRP3蛋白表达和Caspase‑1水解切割显著增多（P＜0.05）。与正常组比较，NBP组小鼠心肌NLRP3蛋白表达和Caspase‑1水解切割差异无统计学意义（P＞0.05）；与Dox组比较，治疗组小鼠心肌NLRP3蛋白表达和Caspase‑1水解切割明显减少（P＜0.05）。上述结果表明，NBP可减少Dox诱导的小鼠心肌组织NLRP3炎症小体的激活。

图3 NBP对Dox小鼠心肌组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的影响Figure3 The effect of NBPon the expression of NLRP3 inflammasome‑related proteins in heart tissue of Dox‑induced mice(±s,n=8)

2.4 NBP对Dox诱导H9C2细胞毒性的影响

如图4A所示，Dox（1、5、25和125μmol/L）可呈剂量依赖性抑制H9C2细胞存活率（P值均＜0.05）。临床上患者在接受Dox化疗时，Dox最大血药浓度为5μmol/L[10]。另外，本实验发现5μmol/L Dox可有效抑制H9C2细胞存活率，故选择5μmol/L Dox诱导H9C2心肌细胞损伤。进一步实验显示，10和50μg/mL的NBP均能增加Dox引起的细胞存活率降低，其中50μg/mL的NBP作用较强（P＜0.05）。因此，本实验拟选用50μg/mL的NBP用于探究NBP是否抑制Dox诱导H9C2细胞NLRP3炎症小体的激活（图4B）。

图4 丁苯酞对阿霉素诱导的H9C2细胞存活率的影响Figure 4 The effect of NBPon Dox‑induced cell viability in H9C2 cells(±s,n=3)

2.5 NBP对Dox诱导的H9C2细胞NLRP3炎症小体相关蛋白的影响

如图5所示，与正常组比较，Dox组细胞中NLRP3蛋白表达、Caspase‑1水解切割显著升高（P＜0.05），说明Dox能诱导NLRP3炎症小体激活；与正常组比较，NBP组NLRP3蛋白表达、Caspase‑1水解切割差异无显著学意义（P＞0.05）。与Dox组比较，治疗组H9C2细胞中NLRP3蛋白表达、Caspase‑1水解切割明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明NBP可抑制Dox诱导的H9C2细胞NLRP3炎症小体的激活。

图5 NBP对Dox诱导的H9C2细胞NLRP3炎症小体相关蛋白的影响Figure 5 The effect of NBPon the expression of NLRP3 inflammasome‑related proteins in Dox‑induced H9C2 cells(±s,n=3)

3 讨论

Dox在临床上抗肿瘤的应用受严重的心脏毒副作用所限制。目前现有药物对Dox所致心肌损伤治疗效果不佳且预后较差，因此，亟待寻找新的安全有效治疗药物。

NBP与芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素结构相同，是人工合成的消旋体，具有抗炎、抗氧化等多种药理作用[11]。本研究发现，NBP既可减轻Dox所致小鼠心肌损伤和改善心功能障碍，也能抑制Dox对H9C2心肌细胞的毒性作用，表明NBP对Dox导致的心肌毒性具有保护作用。Wang[12]和Tian[13]等分别从细胞和动物水平观察到，NBP能保护大鼠心肌缺血再灌注后引起的心肌细胞炎症反应以改善心功能。此外，HAN等[14]报道，NBP可通过抑制炎症反应关键蛋白GSDMD改善主动脉缩窄引起的心肌肥大和心功能失调。结合本实验的结果提示，NBP可能对多种因素所致的心肌疾病均具有一定的保护作用。

HAN等[14]发现，单独使用40 mg/kg NBP腹腔注射5周不会引起小鼠心功能障碍和心肌损伤。本实验中，与正常组比较，单独使用40 mg/kg NBP腹腔注射3周（NBP组）的小鼠心功能无显著性差异且心肌无明显损伤，表明NBP在临床上可能对人体心脏无明显的毒性作用。

NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC适配器蛋白和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶1（Caspase‑1）组成，NLRP3炎症小体的激活可诱导Caspase‑1自我水解激活，进一步促进炎性细胞因子如白介素1β（ⅠL‑1β）的成熟与释放[15]。本团队前期的研究结果显示，Dox可诱导NLRP3炎症小体在心肌细胞中激活，其下游Caspase‑1和ⅠL‑1β水平升高，加重Dox引起的心肌损伤。相反，抑制NLRP3炎症小体能有效减少Dox引起的心肌损伤[16]，表明抑制NLRP3炎症小体激活已成为开发抗Dox所致心肌毒性药物的重要途径。

本实验结果显示，与正常组相比，Dox组心脏组织NLRP3蛋白表达量升高、Caspase‑1切割体含量显著增多；NBP干预能显著减少Dox引起的上述效应。此外，Dox诱导H9C2细胞NLRP3炎症小体激活也能被NBP所抑制。这些体内外结果表明，抑制NLRP3炎症小体以减轻炎症反应发生可能是NBP发挥抗Dox心肌毒性的重要机制。Wang等[17]报道NBP可抑制小鼠脑组织中NLRP3炎症小体的激活以改善阿尔兹海默病，表明NBP可能作为NLRP3炎症小体的广谱抑制剂。NBP抑制NLRP3炎症小体下调的关键信号通路还有待进一步探索。考虑到NLRP3炎症小体的激活参与多种疾病的发生和发展，NBP可能作为炎症小体相关类疾病的候选药物，具有非常重要的临床应用价值。