张政，闫福鹏，杨程皓，刘晨雨，王友朝，周田田，郝吉福

［山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东 泰安 271016］

褪黑素（melatonin,MLT）是松果体分泌的内源性神经激素，影响昼夜节律和细胞功能[1‑4]。由于褪黑素只在夜间分泌并且分泌量极少，而一些时差综合征会使褪黑素的分泌失衡，进而导致睡眠规律紊乱，此时往往需要补充外源性褪黑素来调整机体的生理功能[5‑6]。褪黑素作为一种吲哚杂环化合物，具有较低的水溶性和较高的渗透性，在生物药剂学分类系统中将其划分为Ⅱ型药物。褪黑素作为自由基清除剂及抗氧剂被广泛用于临床治疗中[7]。尽管口服给药常作为临床首选的给药形式，但褪黑素非常短的生物半衰期（t1/2＜30 min）、多变的影响吸收因素以及强烈的首过效应，使口服给药难以作为MLT理想的递送方式[8‑11]。因此，如何有效地递送褪黑素成为亟待解决的问题。

皮肤作为最大的潜在给药组织，经皮递送能够避免肝脏的清除，并能维持恒定的血药浓度[12‑14]。隐形脂质体（stealth liposomes,SLs）是指将药物包封于脂质双分子层中，并且在成膜材料中加入适量膜软化剂（主要是表面活性剂胆酸钠、脱氧胆酸钠、吐温、司盘等）形成的双层囊泡结构[15‑17]。SLs具有高度的变形性及柔韧性，在渗透压的驱动下，能够携载更多的药物穿过皮肤角质层屏障进入体内，进而提高药物经皮递送的效率[18‑19]。以SLs作为经皮递送的载体时，能够与皮肤角质层发生融合，易于变形穿过角质层屏障，在皮肤表面累积形成浓度梯度，促进经皮递送效率，SLs被证明是最有效的药物经皮递送方式之一。

因此，本研究采用薄膜水化法制备荷载褪黑素的隐形脂质体，并采用Franz扩散池法对褪黑素隐形脂质体的体外经皮渗透试验进行了研究，探讨褪黑素隐形脂质体应用于经皮递送的可行性，为褪黑素的应用提供新的递送形式。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BT25S电子分析天平（德国Sartorius公司）；LC‑10A高效液相色谱仪（苏州岛津分析仪器有限公司）；Nano‑S90激光粒度分析仪（英国Malvern公司）；RYJ‑6A透皮扩散实验仪（上海黄海药检仪器厂）；3K30超速离心机（德国Sigma）；RE‑52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；JY92‑2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技公司）；JEM‑1200EX透射电镜（日本JEOL公司）。

1.2 药品与试剂

褪黑素（纯度98%，批号：118674，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；褪黑素对照品（批号520023‑201301，中国食品药品检定研究院，纯度99.8%）；卵磷脂及胆固醇（上海艾伟拓医药科技有限公司）；脱氧胆酸钠（纯度≥99%，北京索莱宝科技有限公司）；三氯甲烷、乙醇等试剂为分析纯。

1.3 动物

昆明种小鼠，体质量（25±5）g，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心提供，实验动物使用许可证号为SCXK（鲁）20080002。

2 方法与结果

2.1 褪黑素隐形脂质体的制备

采用薄膜水化法制备褪黑素隐形脂质体[20]：精密称取褪黑素20.0 mg、卵磷脂80.0 mg、胆固醇20.0 mg和脱氧胆酸钠19.0 mg，共同置于圆底烧瓶中，然后加入10 mL三氯甲烷和无水乙醇的混合溶液使完全溶解，于40℃减压旋转蒸发挥干有机溶剂，在瓶壁上形成薄膜，随后加入10 mL蒸馏水使充分水化，最后采用超声波细胞粉碎机超声15 min，即得褪黑素隐形脂质体。

在隐形脂质体的处方中分别去掉褪黑素和脱氧胆酸钠，同法可相应地制备空白隐形脂质体及褪黑素普通脂质体。

2.2 褪黑素柔性脂质体粒径测定及形貌观察

取上述制备好的褪黑素脂质体100μL，用超纯水稀释至1 mL，采用激光粒度仪测定粒径大小。分别取适量制备好的褪黑素隐形脂质体和空白隐形脂质体滴加到有碳膜的铜网上，静止数分钟后，用滤纸吸去多余的液体，2%磷钨钼酸进行负染，干燥后采用透射电镜（TEM）观察所制备褪黑素隐形脂质体的外观形貌。

由图1A和图1B的粒径分布结果可见：所制备的褪黑素隐形脂质体的平均粒径为（48.87±1.56）nm，PDⅠ为0.203；空白隐形脂质体的平均粒径为（68.77±2.21）nm，PDⅠ为0.260，表明所制备的脂质体平均粒径小于100 nm，且分布较为均匀（PDⅠ＜0.3）。TEM检测结果（图1C和图1D）显示，所制备的脂质体呈规整的圆球状，无聚集现象。

图1 隐形脂质体的粒径分布图及透射电镜图Figure 1 The diagrams of the particle size distribution and TEM of MLT SLs

2.3 褪黑素隐形脂质体包封率和载药量测定

采用超滤离心法测定褪黑素隐形脂质体的包封率和载药量[21]。精密量取所制备的褪黑素隐形脂质体溶液200μL，置于超滤离心管中（截留相对分子质量4 000），在4℃条件下，8 000 r/min离心20 min。精密量取超滤管外管中溶液50μL，加入4.0 mL甲醇，采用HPLC法测定褪黑素浓度，根据标准曲线计算褪黑素含量，将其作为游离褪黑素的量。根据以下公式计算脂质体的包封率（EE）和载药量（DL）：

其中：M表示隐形脂质体中褪黑素总投药量；M1表示隐形脂质体中游离的褪黑素药物含量；W表示隐形脂质体中磷脂、胆固醇、脱氧胆酸钠及药物的总质量。

结果表明所制备的褪黑素隐形脂质体的包封率和载药量分别为73.91%和9.92%。

2.4 体外经皮渗透试验

2.4.1 离体小鼠皮肤的制备 将昆明小鼠用脱毛膏脱去腹部毛发后，生理盐水洗净，饲养24 h后颈椎脱臼处死，剥离脱毛的腹部皮肤，去除皮下脂肪组织，然后用生理盐水清洗干净后待用。

2.4.2 体外经皮渗透试验 采用改良的Franz扩散池中进行体外经皮渗透试验。将制备好的小鼠皮肤平铺在Franz扩散池的供给池和接收池中间，用特定的夹子固定，皮肤角质层朝向供给池，扩散池的有效渗透面积为3.5 cm2，接收池体积为6.5 mL，磷酸盐缓冲液（pH 7.2~7.4）作为接收介质。将Franz扩散池放置在药物透皮扩散试验仪支架中，温度设置为37℃，搅拌速度维持300 r/min恒速搅拌。然后将1.0 mL褪黑素隐形脂质体与褪黑素普通脂质体均匀涂布在小鼠皮肤的角质层表面，分别在0.5、1、2、3、4、6、8、10、24 h时取样，每次取样体积为3.0 mL，每次取样后补加等温度、等量的磷酸盐缓冲液。

2.4.3 样品测定方法及数据处理

2.4.3.1 褪黑素紫外吸收波长的确定 精密称取褪黑素对照品5.03 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，以甲醇为空白对照，用紫外分光光度计在200~400 nm波长范围内进行扫描，结果表明褪黑素在223 nm波长处有最大吸收。

2.4.3.2 褪黑素标准曲线的制备 精密称取褪黑素4.0 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入甲醇溶液后摇匀使充分溶解，定容至刻度，作为储备液。取储备液适量，用甲醇稀释分别制成质量浓度为0.010、0.015、0.020、0.030、0.035、0.040 mg/mL的系列标准溶液。取上述系列质量浓度的褪黑素溶液适量，分别在223 nm处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标、质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程A=23.76C-0.075，R2=0.999 4，表明褪黑素在0.01~0.04 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

2.4.3.3 精密度及稳定性试验 取质量浓度分别为10.0、20.0、40.0μg/mL的褪黑素溶液，在223 nm处测定吸光度，连续测定5次，考察不同质量浓度下的精密度。结果表明所测得低、中、高3种质量浓度褪黑素溶液的RSD均小于2.0%，符合方法学要求。

取质量浓度分别为10.0、20.0、40.0μg/mL的褪黑素溶液，分别于配制后0、4、8、12、24、48、72 h于223 nm处测定吸光度，结果表明所测得低、中、高3种质量浓度褪黑素溶液的吸光度RSD值均小于5.0%，符合方法学要求。

2.4.3.4 体外透皮释放样品测定及数据处理 取出的接收液用0.45μm微孔滤膜滤过后，弃去初滤液，续滤液用于测定褪黑素的浓度。于223 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算不同时刻褪黑素脂质体经皮渗透量。根据下列公式计算累积渗透量（Q）、透皮速率常数（Jss）及渗透系数（P）：

式中：S为Franz有效扩散面积（cm2）；V为接收池中接收液体积（mL）；Ci为第一次至上次取样时接收液中药物质量浓度（mg/mL）；Cn为n时间点测得的药物质量浓度（mg/mL）：Vi为取样体积（mL）；V为接收池中的接收液的总体积（mL）。

以褪黑素体外经皮的累积渗透量为纵坐标、时间为横坐标，绘制2种类型的褪黑素脂质体经皮累积渗透量曲线，结果如图2所示。对曲线中的直线部分进行线性回归，计算渗透动力学参数，结果见表1。

表1 褪黑素脂质体体外经皮渗透动力学参数表Table 1 The parameters of in vitro transdermal penetration of melatonin(stealth)liposomes

图2 褪黑素脂质体的体外经皮累积释放量曲线Figure 2 In vitro transdermal penetration profiles of melatonin(stealth)liposomes

可见，褪黑素隐形脂质体和普通脂质体24h单位面积累积渗透量（Q）分别为0.251 4、0.165 5 mg/cm2，透皮速率常数（Jss）分别为0.017 6、0.008 7mg/（cm2·h）。结果表明，与普通脂质体组相比，褪黑素隐形脂质体单位面积累积渗透量和渗透速率分别提高了1.5倍和2倍，显示出较快的渗透性。由图2可知，随着时间的推移，隐形脂质体的单位面积累积渗透量较普通脂质体越来越大。表明将褪黑素制备成隐形脂质体可进一步提高经皮透过效率。

2.5 褪黑素隐形脂质体透皮机制研究

2.5.1 皮肤表面扫描电子显微镜（SEM）分析 采用SEM观察给予褪黑素隐形脂质体后对皮肤角质层结构的影响。以生理盐水作为对照，分别将生理盐水和褪黑素隐形脂质体涂布于脱毛小鼠背部，12 h后处死小鼠，取下给药部位的皮肤，置于戊二醛溶液中固定24 h，使用分级乙醇进行脱水干燥，将处理过的皮肤样品进行SEM观察，结果见图3。

图3 小鼠皮肤角质层扫描电镜图Figure 3 The SEM pictures of mice stratum corneum

从皮肤表面角质层结构来看，对照组皮肤表面粗糙，角质层细胞呈杂乱层堆状不规则排列，角质层细胞间隙不明显。经隐形脂质体处理后的皮肤表面比较平整光滑，角质层细胞水化程度较高，细胞间隙明显增加。

2.5.2 皮肤结构的差示扫描量热法（DSC）及红外光谱（FTⅠR）分析 将经生理盐水和褪黑素隐形脂质体处理12 h后的小鼠背部皮肤取下，用研钵研磨（研磨过程中不断加入液氮，以免皮肤软化粘连），然后置于冷冻干燥机中进行冻干，将获得皮肤冻干粉分别进行DSC及FTⅠR测定。其中DSC测定条件：测试温度设定为20~250℃，加热速率为10℃/min，并在氮气保护下进行测定。FTⅠR测定：将皮肤冻干粉与KBr压片后在400~4 000 cm-1扫描范围内用红外光谱仪进行光谱扫描。结果见图4。

从DSC曲线（图4A）可知，在110~120℃温度范围内出现角蛋白变性特征峰，与对照组相比，经隐形脂质体处理后角蛋白熔点升高，表明角蛋白的螺旋结构发生变化。

从红外结果（图4B）可知，皮肤样品的红外特征吸收峰为角质层脂质峰（νasCH2，νsCH2，νsC=O）和角蛋白峰（酰胺Ⅰ，酰胺Ⅱ）。与对照组相比，经隐形脂质体处理后，角质层脂质峰发生右移，提示制备脂质体所使用的磷脂可以改变角质层的脂质结构，能够影响皮肤角质层中的脂质的流动性。

图4 小鼠皮肤的DSC图（A）和FTⅠR图谱（B）Figure 4 The DSC(A)and FTⅠR(B)profiles of mice skin

3 讨论

本研究以磷脂、胆固醇及脱氧胆酸钠为成膜材料，采用薄膜水化法制备荷载褪黑素的隐形脂质体，并通过粒度分析及透射电镜对所制备的脂质体进行了表征。结果显示所制备的隐形脂质体粒径分布小于100 nm，外观呈规则的圆球状，符合纳米载体的特征，同时具有较高的包封率和载药量。但荷载褪黑素隐形脂质体的粒径比空白粒径小，出现此现象的原因可能与模型药物褪黑素具有两亲结构有关。其分子结构中含有亲水的酰胺基团，另一侧为疏水的苯环结构，模型药物本身具有两亲结构，加入后能够更大程度地降低表面张力，使形成的脂质体的粒径减小。

体外经皮渗透试验研究结果显示，褪黑素隐形脂质体缓慢释放，由于内源性物质的褪黑素分泌后能够迅速进入血液循环分布到机体各部分，在体内的含量极少，以pg级（1×10-12g）水平存在，因此推测痕量的药物能够改善睡眠障碍。然而，目前仍缺少有效的评价实验动物睡眠障碍的模型，药效学研究尚需在后续中进一步开展。

与褪黑素普通脂质体相比较，隐形脂质体24 h的单位面积累积渗透量明显高于普通脂质体组，这可能是由于脱氧胆酸钠插入磷脂双分子层中间，增加了磷脂分子间的距离，改变了磷脂酰基链的顺序，增加了脂质膜的流动性，使隐形脂质体具有高度的变形能力，可以借助于自身发生形变的能力顺利通过皮肤角质层。其次，隐形脂质体中的磷脂可与皮肤角质层中的脂质层融合，使角质层中的脂质组成和结构发生改变；此外，隐形脂质体可增加角质层的水合作用，使角质细胞间隙增大，从而导致皮肤角质层的屏障作用发生逆转，SEM结果进一步证实，经隐形脂质体处理后皮肤表面的角质层结构细胞间隙明显增加，表明隐形脂质体可改变皮肤角质层的致密结构，为药物顺利通过角质层屏障奠定了基础。由DSC及FTⅠR结果可知，经隐形脂质体处理后，皮肤角蛋白和脂质结构发生了变化，表明隐形脂质体可通过改变角蛋白的螺旋结构来降低角质层的屏障功能，此外皮肤脂质中脂质酰基链的旋转自由度增加，使皮肤脂质的流动性增加，继而导致渗透性增强[22]。

综上所述，本研究制备荷载褪黑素的隐形脂质体并进行了体外经皮渗透试验，探讨了其作为载体促进经皮吸收的促透机制，为褪黑素的进一步开发和利用提供了新的给药形式，后续工作将进行相关的药效学研究，以期为睡眠障碍提供新的治疗策略。