刘世祥, 张荣胜, 刘永锋, 谷祖敏, 于俊杰*,

(1. 沈阳农业大学 植物保护学院，沈阳 110866；2. 江苏省农业科学院 植物保护研究所，南京 210014)

木霉在土壤中和植物上分布广泛，是一种具有生防潜力且资源丰富的微生物，以木霉属真菌为核心开发的生物防治菌剂是目前主要的生物农药类型之一[1-3]。目前已报道具有较好生防作用的木霉属真菌包括哈茨木霉Trichoderma harzianum、棘孢木霉T. asperellum、康宁木霉T. koningii、拟康宁木霉T. pseudokoningii、绿色木霉T. virens、深绿木霉T. atrovirens和长枝木霉T. longibrachiaum等[4-5]，其中多种深绿木霉被发现具有拮抗、重寄生、诱导植物抗病性等作用[6-10]。在前期研究中分离到一株深绿木霉TA-9，该菌株对稻曲病菌和水稻纹枯病菌具有重寄生作用，将其发酵混合物稀释后喷施水稻，对稻曲病和水稻纹枯病均具有较好的防控效果[11]。木霉的分生孢子相较其菌丝具有抗逆性强、易贮存等优点，通常可利用木霉分生孢子进一步开发形成相关植物病害生防制剂[12-13]。初步固体发酵结果表明，深绿木霉TA-9 能产生大量的分生孢子，但是较已报道的木霉分生孢子产量稍低，应仍有一定的优化提高产量的空间。

目前，国内外通过固体发酵获得木霉菌分生孢子的研究很多，通常是采用当地易获得的廉价发酵培养基或者农业加工中产生的废料[14-15]，如米糠、玉米秸秆、稻麦秸秆、椰子壳粉、酒糟等。本研究中，使用在我国稻麦种植区常见农业加工副产品麦麸和谷壳作为主要发酵基质，并在其中添加低价值、易获得的补充碳氮源、无机盐和微量元素。Plackett-Burman 试验设计和响应曲面法是优化培养基配方和培养条件的重要研究方法，本研究拟通过系统的研究探索，以期获得低成本、高产出的深绿木霉分生孢子的固体发酵培养基和培养条件，并为该深绿木霉生防菌剂的工业化发酵生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

深绿木霉Trichoderma atrovirideTA-9 菌株由江苏省农业科学院植物保护研究所水稻病害研究室分离和保存。

1.2 培养基

PSB 培养基：将200 g 去皮马铃薯煮沸滤出液和20 g 蔗糖混合，定容至1 L。PSA 培养基：在PSB 培养基中加入16～20 g 琼脂粉。

发酵营养液：将蔗糖40%、硫酸铵2%、磷酸二氢钾2%、微量元素母液 (体积比) 1%、酶水解酪蛋白0.6%和黄豆粉2%混合，加热后备用。

微量元素母液 (1 L)：H3BO3、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O 和Na2MoO4·2H2O 各100 mg[16]。

1.3 试验方法

1.3.1 深绿木霉TA-9 固体发酵种子液的制备 将深绿木霉TA-9 分生孢子在PSA 培养基中涂布均匀，置于25 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，从菌落边缘挑取适量菌丝接种于PSB 培养液中，于25 ℃、120 r/min 条件下振荡培养6 d 后，用无菌纱布过滤除去菌丝，获得深绿木霉分生孢子，用无菌水将孢子浓度调节至每毫升1 × 107个孢子，待用。

1.3.2 深绿木霉TA-9 固体发酵产物中分生孢子含量的测定 固体发酵物于45 ℃烘干3 h 至完全干燥。称取1 g 发酵物，用含0.1%吐温-80 的无菌水稀释，涡旋振荡1min 后，用移液枪吸取适量菌液，使用血球计数板统计深绿木霉TA-9 孢子的数量，3 次重复，结果取平均值。

1.3.3 深绿木霉TA-9 产分生孢子固体发酵培养基的优化

1.3.3.1 培养基关键因素的筛选 培养基组分关键因子筛选：采用Plackett-Burman 设计(PB)[17]。从A1-蔗糖 (10%～30%)、B1-硫酸铵 (0.8%～1.2%)、C1-磷酸二氢钾 (0.8%～1.2%)、D1-混合矿物质(0.2%～0.8%)、E1-酪氨酸 (0.1%～0.5%)和F1-黄豆粉 (0.8%～1.2%) 6 个因素中筛选关键因子。试验中每因素取2 水平：即高水平 “1” (范围区间最大值)和低水平 “−1” (范围区间最小值)。试验中设计5 个冗余变量：G1、H1、I1、J1、K1。

培养条件关键因子筛选：采用Plackett-Burman设计。从A2-温度 (20～28 ℃)、B2-发酵时间 (6～8 d)、C2-接种浓度 (1 × 104～1 × 106个孢子/mL)、D2-含水率 (35%～55%)、E2-搅拌周期 (24～60 h)和F2-种子液菌龄 (6～8 d) 6 个因素中筛选对菌株TA-9 生长具有显著影响的因子。试验中每因素取2 水平：即高水平 “1” 和低水平 “−1”。试验中设计5 个冗余变量：G2、H2、I2、J2和K2。每组试验3 次重复，结果取平均值。

1.3.3.2 最陡爬坡的试验 参考培养基和培养条件关键因子试验筛选结果，分别从以上因素中筛选出3 个最关键影响因子，设计最陡爬坡试验。根据模型中各变量的系数确定关键因素的爬坡方向和步长[18]，确定关键因素的最优范围，以此得到的深绿木霉TA-9 孢子产量最大点成为中心组合设计试验的中心点，从而确定培养基关键组分的添加质量比范围和培养条件的范围。

对承包人制定的施工方案内容和完整度进行考核；技术方案要求严格执行专家组汇商、领导审批的流程，对是否执行审批流程情况进行考核；对承包人交底流程及监控力度进行考核；对重点环节的验收制度进行考核；对井队进行特殊环节作业的负责人进行考核。

1.3.3.3 关键因素中心组合的试验 以Box-Behnken 响应曲面法(BBD)设计3 因子2 水平设计中心组合试验，对关键因素进行优化。以深绿木霉TA-9 孢子产量为响应值，对试验结果进行分析。预测深绿木霉TA-9 孢子产量达到最大值所对应的关键因子参数。

1.3.3.4 数据统计分析 培养基关键因素的筛选设计和Box-Behnken 响应曲面法试验设计采用Design-Expert 8.0 软件设计。利用Duncan’s 新复极差法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 培养基组分中的显著影响因子

由于基础发酵培养基中麦麸和谷壳的比例在前期试验中已经过优化，本试验中将通过Plackett-Burman 法设计试验，以明确发酵营养液中关键营养组分。对初始发酵营养液中蔗糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、微量元素母液、酶水解酪蛋白和黄豆粉共6 组影响分生孢子产生的因素进行考察，同时设置空项以估计试验误差，试验设计如表1 所示，每个因素取高低2 个水平。在接种量1%、温度25 ℃光照培养的条件下发酵7 d。检测结果如表1 所示，采用Design Expert 8.0.6 软件进行回归分析得到最佳拟合方程为Y1= 106.52−63.43A1+10.39B1+ 11.54C1+ 1.89D1+ 0.94E1−4.39F1，公式中Y1为深绿木霉TA-9 孢子产量的预测值。由校正系数可知Y1的变化有91.32%能被回归方程解释，表明该模型对培养基关键影响因子有作用。表2 中显示的数据证明拟合的回归方程是合理的(P<0.05)，6 个因素中关键影响因子为蔗糖、硫酸铵和磷酸二氢钾，这3 个关键因子变化显著影响深绿木霉TA-9 分生孢子产量 (P<0.05)。

表1 培养基关键因素PB 试验设计及结果Table 1 Design and results of PB test on key factors of culture medium

表2 培养基关键因素PB 试验设计的方差分析Table 2 Variance analysis of the design of PB test for key factors of culture medium

由试验分析结果可知，培养基组分中影响深绿木霉TA-9 固体发酵孢子产量的关键因子为蔗糖、硫酸铵和磷酸二氢钾。关键因子的爬坡方向由方程的各变量系数确定，培养基组分最陡爬坡试验设计及结果见表3，关键因素组合不同，深绿木霉TA-9 分生孢子产量不同，深绿木霉TA-9 孢子产量最大值的编号为2，响应曲面试验的中心值选择该组编号数据 。

表3 培养基组分最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Experimental design and results of the steepest climb of medium components

2.2 培养基组分关键因子的最优配比

以蔗糖、硫酸铵和磷酸二氢钾3 个关键因素为自变量，设计中心组合试验，得到关键因子编码方程为Y2= 236.55−1.24A1+ 2.42B1+ 0.85C1+8.83A1B1+ 0.97A1C1+ 8.83B1C1− 6.12A12−30.43B12−12.96C12。公式中Y2为孢子产量的预测值。检验表明R2= 0.9977，校正R2= 0.9836；关键因子对Y的影响中有98.36%能被回归方程解释，回归方程的方差分析结果显示回归方程具有显著性 (P<0.05)。绘制蔗糖、硫酸铵和磷酸二氢钾交互作用影响的响应曲面和等高线，图1可直观反映出深绿木霉TA-9 分生孢子产量受到的影响。通过回归方程计算得出，培养基中蔗糖、硫酸铵和磷酸二氢钾质量比分别为24.75%、0.88%和0.88%时响应值最大。对应的培养基组分最优配比为：麦麸30%，谷壳20%，蔗糖24.65%，硫酸铵0.88%，磷酸二氢钾0.88%，黄豆粉1%，混合矿物质0.5%，酶水解酪蛋白0.3%。

2.3 培养条件中的显著影响因子

按照培养基最优配比配制固体发酵培养基，随后对发酵温度、发酵时间、接种孢子浓度、含水率、搅拌周期和种子液菌龄共6 组影响分生孢子产生的培养条件因素进行考察，同时设置空项以估计试验误差，试验设计如表4 所示，每个因素取高低2 个水平。通过试验设计分析深绿木霉TA-9 固体发酵产孢培养条件的影响关键因素，设计方案及试验结果见表4。关键培养条件因素编码方程为Y3= 212.40 − 6.87A2+ 1.71B2+ 25.97C2+77.36D2+ 1.97E2+ 3.25F2，R2= 0.9745，校正R2=0.9206。公式中Y3为深绿木霉TA-9 分生孢子产量的预测值。由校正系数可知，Y3的变化中92.06%能被回归方程解释，表明该模型对培养基关键影响因子有作用，最大产孢量为编号为10 的组合，孢子产量为2.2 × 1010个/g。从表5 可以得知，回归方程显著 (P<0.01)。温度、接种浓度和含水率在6 个培养因素中是关键因子，其变化显著影响深绿木霉TA-9 孢子产量。

2.4 培养条件关键因子的最优范围

影响深绿木霉TA-9 分生孢子产量的关键因子为温度、接种浓度和含水率，得到培养条件因素编码方程，进行数据分析。关键因子的爬坡方向由方程各变量系数确定，最陡爬坡试验设计和试验结果见表6。由表中可以看出，不同组合深绿木霉TA-9 孢子产量不同，产量最大组合编号为3，孢子产量为2.1 × 1010个/g，响应曲面试验的中心值选择该编号，继续开展试验。

表6 培养条件最陡爬坡试验设计及结果Table 6 Design and results of steepest climb test under culture conditions

2.5 培养条件关键因子的最优配比

根据最陡爬坡试验结果 (表6) 确定了Box-Behnken 试验设计的各水平取值 (表7)，以温度、接种浓度和含水率3 个关键因素为自变量，对深绿木霉TA-9 孢子产量数据进行二次多项回归拟合，得到关键因子动态模型为Y4= 298.01 +4.96A2− 6.79B2− 0.083C2+ 1.08A2B2− 2.17A2C2−21.50B2C2− 46.29A22−39.29B22− 22.88C22。R2= 0.9951，校正R2= 0.9852。公式中Y4为深绿木霉TA-9 孢子产量的预测值。表明该回归方程有98.52%的概率去解释关键因素对Y4的影响，显示回归方程具有显著性。

表7 培养条件BBD 试验设计及试验结果Table 7 Culture conditions BBD test design and results

由Design Expert8.0.6 根据表7 数据得到的响应曲面图 (图2)，揭示了温度、接种浓度和含水率3 种关键因子两两相互作用对分生孢子产量的影响。由响应曲面规范分析可知，回归模型存在最大值，当接种浓度5.2 × 105个/g 和含水率48.1%时，在种子液菌龄6 d、24.1 ℃光照培养、接种60 h 后搅拌、静置发酵至8 d 条件下，预测分生孢子产量最大值为2.24 × 1010个/g。

图2 培养温度、接种浓度和含水率影响深绿木霉TA-9 分生孢子产量的等高线(A、C、 E)和响应曲面（B、D、F）Fig. 2 Contour (A, C, E) and response surface (B, D, F) of culture temperature, concentration of inoculated conidia and moisture content affecting conidial yield of Trichoderma atroviride TA-9

2.6 试验结果的发酵验证

为了验证模型的可靠性，根据预测的最优条件进行4 次重复试验，深绿木霉TA-9 固体发酵分生孢子产量为2.44 × 1010个/g，实际值比预测值略高 (P<0.01)，表明所构建的模型可靠，能够较准确预测真实值。初始培养条件下，深绿木霉TA-9 固体发酵分生孢子产量为1.84 × 1010个/g，优化后的培养条件与初始培养条件相比，其分生孢子产量提高了30.98%，显示了较好的优化效果。为了进一步检测分生孢子的萌发活性，通过涂布PSA 培养基测定了文中所述最佳发酵条件下获得的分生孢子的萌发率。结果显示，发酵完成后收集的深绿木霉TA-9 分生孢子平均萌发率为99.2%；在45 ℃热风处理3 h 并完全烘干后，其平均萌发率仍可达93.6%，可用于进一步剂型加工。

3 讨论

由于木霉的分生孢子具有易发酵、易保存、易加工制剂的优点，目前木霉生防制剂大多是利用其固体发酵产生的分生孢子进一步加工形成的[10,19]，但目前大多数木霉固体发酵响应曲面优化研究主要集中在固体发酵产生工业用酶、次生代谢产物等方面[20-22]，研究涉及木霉的分生孢子发酵的优化不多，且大多使用单因素或正交法优化木霉的分生孢子固体发酵。仅有少数研究通过响应曲面法优化绿色木霉的分生孢子发酵培养基的优化[23]，但该研究并未涉及培养条件的优化。本研究前期分离获得生防深绿木霉菌株TA-9，为进一步开发基于TA-9 的木霉生防菌剂，通过响应曲面法较为全面地优化了固体发酵培养基和培养条件。考虑结合工业化生产，本研究采用在我国稻麦种植区成本低廉的麦麸和谷壳作为主要发酵原料，通过Plackett-Burman 设计对关键因子进行筛选；通过最陡爬坡试验确定关键因子的最适浓度范围；选取蔗糖、硫酸铵和磷酸二氢钾作为发酵基质中重要影响因子，选取培养温度、接种浓度和含水率作为发酵条件中的重要影响因子，进行Box-Behnken 试验设计，并借助Design Expert 8.0.6 软件进行数据分析并确定优化条件，通过试验验证得到最佳培养基配方和培养条件，提高了分生孢子产量30%以上。鉴于本研究中探索深绿木霉固体发酵工艺是为进一步进行木霉制剂加工作准备，因而不仅要提高分生孢子产量，而且需要保证其具有较高萌发活性。研究中检测了新鲜发酵和烘干后分生孢子的萌发率，确认了发酵获得的分生孢子具有较好的萌发活性，并适合进一步的制剂加工。本研究为进一步的工业化发酵提供了理论基础。

前期单因素研究中，已确定了谷壳和麸皮的使用质量比为2:3 时分生孢子产量最高，其中谷壳具有疏松固体培养基、调节通气量的作用，本研究中作为培养基中的固定成分，不在响应曲面法优化培养基的研究中进行评估。前期研究中同时确定了蔗糖为主要碳源、麸皮为辅助碳源；硫酸铵为主要氮源、酶水解酪蛋白和黄豆粉作为辅助氮源；其中蔗糖和硫酸铵作为可直接利用的碳、氮源，有助于发酵前期木霉的快速生长和产生分生孢子。此外，磷酸二氢钾和微量元素混合液对深绿木霉TA-9 的分生孢子形成也具有较好的促进作用。通过响应曲面法优化，最终确定了最优培养基为：麦麸30%、谷壳20%、蔗糖24.65%，硫酸铵0.88%，磷酸二氢钾0.88%，黄豆粉1%，混合矿物质0.5%，酶水解酪蛋白0.3%。

本研究也进一步优化了固体发酵条件，最终确定最优培养条件为：接种浓度每克基质含5.2 ×105个孢子、含水率48.1%、种子液菌龄6 d、24.1 ℃光照培养、接种60 h 后搅拌，随后静置发酵至8 d。鉴于本研究前期通过单因素试验考察了多种光照条件下深绿木霉TA-9 固体发酵产生分生孢子的产量，结果如下：全光照培养 >光暗交替(光18 h，暗6 h) >光暗交替 (光12 h，暗12 h) >光暗交替 (光6 h，暗18 h) >全黑暗培养，因而本研究中使用全光照条件进行固体发酵，并未将其作为重要发酵条件因子通过响应曲面法进行优化。然而，已报道的木霉菌固体发酵相关研究结果表明，光暗交替条件通常有利于木霉菌分生孢子形成[24-26]，与本研究结果并不一致。提示木霉菌菌株个体在产生分生孢子时对光照条件的反应可能会有所差异，针对不同的木霉菌菌株个体，仍需要考察光照周期对其产生分生孢子的影响。此外，光照强度、偏好波长等因素对木霉菌分生孢子形成的影响也需要进一步研究。

在响应曲面法优化培养基质和培养条件后，预测分生孢子产量最大值为每克培养基含2.24 × 1010个孢子，而以优化后的发酵培养基和培养条件培养，深绿木霉TA-9 固体发酵实际获得分生孢子产量为2.44 × 1010个/g，且分生孢子在烘干后仍具有较好的萌发活性，有利于进行木霉菌剂的制备和生产。本研究结果可为大规模发酵提供依据，但在大规模发酵生产时仍需要根据实际情况进行进一步优化。同时，本研究还可为其他木霉以及真菌的固体发酵产分生孢子的优化提供参考。