沈嘉森，苏永昌，林河通，李水根，陈晓婷，刘智禹*

(1.闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；3.福建水产研究所，国家海水鱼类加工技术研发中心，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；4.福建海洋职业技术学校，福建 福州350002)

高血压是以动脉收缩压或舒张压增高为特征的慢性病，同时是引起多种并发症的心血管疾病[1]。目前，常见的沙坦类、普利类等降血压药都有良好的降压效果，但易引起血胆固醇、甘油三酯升高，提高糖脂代谢异常等糖尿病的发病机率，引发蛋白尿等肾衰竭症状，更严重者还会导致心率过缓、诱发急性心力衰竭[2]。而天然提取的降血压抑制肽生物活性多[3-4]、经济价值高、易消化吸收、安全性高等[5]特点受到广泛关注。围绕食源性血管紧张素转化酶(Angiotensin-I converting enzyme，ACE)抑制肽开发高效的降血压活性产品具有很高的研究价值。但绝大多数抑制肽只在活性上做研究，未能对制备工艺、分离纯化体系作出总结[6]。因此，本文归纳ACE抑制肽的发展及维持血压平衡作用的关系，从ACE抑制肽的工艺制备、分离纯化鉴定、构效关系、体内外活性评价研究方面展开论述，以期为深入研究ACE抑制肽奠定基础。

1 ACE抑制肽概况

ACE属二肽外肽酶，是含锌元素的羧基肽酶。作为机体肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)中的调节剂，广泛分布于肺、睾丸等组织脏器中[7-8]。在平衡血压方面，血浆中的ACE酶将无活性的十肽血管紧张素Ⅰ(Ang Ⅰ，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)的羧基端水解成有活性的八肽血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ，Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)和二肽的组氨酰亮氨酸(His-Leu)，从而促进血管收缩、血压升高。除了诱导血管紧张素Ⅱ收缩外，它还作用于激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin system，KKS) 抑制缓激肽(Bradykinin，BK)分解成无活性片段，也会使血压增高[9]。

血管紧张素转化酶抑制肽(Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides，ACEⅠ)是通过抑制Ang Ⅱ的合成或减少缓激肽的释放，从而为降低血压提供有效途径[10]。ACE抑制肽在平衡血压中起到决定性作用。Oshima G等[11]最早是在明胶食物中进行细菌胶原酶降解时获得的ACE抑制肽，通过分析其氨基酸组成和SephadexG-25证实了其6条ACE抑制活性较强序列主要集中在分子量较小的部分；Wang J P等[8]研究的牡蛎纯化ACE抑制肽VVYPWTQRF(Val-Val- Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe)对小鼠有降压活性。因此，研究ACE抑制肽对高血压患者治疗有积极作用和广阔前景[12]。

2 ACE抑制肽的制备

ACE抑制肽以食源性蛋白为原料，包括马铃薯[13]、葵花籽[14]、昆虫[15]、牡蛎[16]、禽类[17]等动植物，通过酸碱提取法、微生物发酵法、虚拟水解法及酶解法等制备方法[18]进行提取。

2.1 酸碱提取法

酸碱提取法是指利用适量的酸或碱与蛋白源生物体反应，通过调节pH使蛋白成分溶解析出的一种提取方式，但成本较高、提取效率极低。范彦娜等[19]通过碱溶酸沉的方式直接从枸杞提取ACE抑制肽，多肽粗蛋白提取含量仅占34.15%，ACE活性约为71.15%。杨敏[20]以鲽(Paralichthysolivaceus)鱼皮为原料，通过加入磷酸浸泡提取胶原蛋白，结果表明磷酸可提取出典型的Ⅰ型胶原蛋白，提取得率达41.1%。

2.2 微生物发酵法

微生物发酵法利用微生物代谢发酵产生的蛋白酶将原料中的蛋白质酶解成小分子生物活性肽，该法成本低，可获得较好的ACE抑制活性，但操作繁琐[21]。姚雨杉[22]利用纳豆芽胞杆菌发酵鱿鱼加工副产物，通过响应面分析得到最佳工艺参数：在发酵时间37.5 h、发酵温度42.1℃、接种量6.0%、料液比22.7的条件下制备样品，测得其ACE抑制率为82.22%。高洁等[23]采用纳豆菌发酵扇贝裙边，通过单因素和响应面方法的结合，在发酵时间38.4 h、发酵温度39.9℃、接种量6.0%、料液比22.5的工艺下得到的ACE抑制率为83.70%。

2.3 虚拟水解法

虚拟水解是利用已知蛋白序列，借助计算机的特定酶解技术进行酶切，将水解得到的特定小肽进行数据库筛选比对[24]，找到高活性的多肽，此法可直接获得特定的多肽序列，且抑制活性较好，但模拟筛选的方式较传统酶解方法仍有较多不确定的因素。纪慧卓等[25]基于生物信息学的方式，以大黄鱼为蛋白源虚拟酶解出CMK、GWR、 WAK 和 WQK，其IC50分别为 0.19、2.40、0.40、1.10 mmol/L。于志鹏等[26]虚拟酶解鸡蛋蛋白，通过生物活性、分子质量、水溶性、吸收代谢等性质预测出与ACE能稳定结合的FQK、WGK、ADW，其IC50分别为(250±0.25)、(222.74±1.02)、(85.38±0.54)μmol/L。

2.4 酶解法

酶解法是由于蛋白酶具有不同的特异性酶切位点，将蛋白质分子酶切成多个小片段的氨基酸序列，从而获得具有降血压功效的ACE抑制肽等天然产物，是目前制备活性肽最常用的方法，具有专一性和高效性等特点[27-28]。Lee J K等[29]利用6种蛋白酶在适宜水解条件下酶解鲑(Oncorhynchusketa)鱼皮，结果显示胰蛋白酶的IC50为1.08 mg/mL，表现出最高的ACE抑制活性。Khiari Z等[30]在胃蛋白酶酶解24 h条件下，研究获得的鱼皮副产物多肽的ACE抑制活性为74.1%，具有抗氧化、降血压等多种生物活性。

3 ACE抑制肽的分离纯化

食源性的蛋白通过多种提取方式加工制备混合多肽，但其酶解液成分复杂，要研究多肽的生物活性还需进一步分离纯化[31]。目前，多肽的提取制备主要基于膜分离、凝胶层析和离子交换层析等技术及反向高效液相色谱法进行逐级分离纯化[32]。

3.1 膜分离技术

膜分离技术(Membrane separation technique，MST)是多肽的混合物根据不同分子量的孔径大小，通过陶瓷膜和超滤膜等，实现选择性分离的技术，可达到分离提纯的目的[33]，其在常温下有效成分损失少、操作方便、浓缩成本低。目前，根据孔径的截留量划分为微滤(Microfiltration，MF)、超滤(Ultrafiltration，UF)、纳滤(Nanofiltration，NF)等。本文介绍的超滤技术是利用膜的两侧能量差作为推动力，通过超滤膜表面的微孔结构，截留分子量范围在1～300 kDa的蛋白质、多肽等分子。Cao D等[34]通过超滤得到>10 kDa、3～10 kDa和<3 kDa三个组分，提取<3 kDa的龙须菜胰蛋白酶多肽液具有(78.15±1.56)%的ACE抑制活性。宋华曾等[35]超滤鱼回(Ictaluruspunctatus)鱼皮明胶提取液，得到>3 kDa和<3 kDa两组分多肽，体外活性评价表明<3 kDa的抑制活性优于>3 kDa，并进一步在小鼠体内获得了验证。综上研究表明，小分子量多肽的生物活性优于大分子量多肽[36]。

3.2 凝胶层析技术

凝胶层析技术(Gel filtration chromatography，GFC)也称分子筛/排阻色谱，基于不同分离物的蛋白分子量大小差异，根据凝胶筛分子量大的先出峰的洗脱原理获取活性高的目标物质[37]，其操作条件温和、不需要有机溶剂、能分离出高分子物质，但对于分子量接近的蛋白质分离效果较差。Lin Y H等[38]利用Sephadex G-15凝胶柱将PN-1蛋白洗脱出7个组分，其F组分显示最高的IC50，为0.015 mg/mL。Zhang T等[39]通过Sephadex G25、Superdex 10/300 GL纯化获得的牡蛎蛋白G1E1的IC50为0.045 mg/mL。

3.3 离子交换层析

离子交换层析(Ion-exchange chromatography，IEC)利用蛋白质分子所带电荷的不同这一特性，在一定pH浓度下与离子交换剂进行分离洗脱，从而达到分离提纯的目的[37]，但遇到特殊的蛋白结构则难分离。Liu P R等[16]通过固定化金属离子交换纯化了两种新颖的ACE抑制肽His-Leu-His-Thr(HLHT)和Gly-Trp-Ala(GWA)，IC50值分别为(458.06±3.24) μmol/L和(109.25±1.45) μmol/L。Wu S G等[40]利用IEC离子交换层析从鱼肉蛋白水解产物中纯化出新型ACE抑制肽Arg-Val-Cys-Leu-Pro(RVCLP)，对其进行体外ACE抑制活性研究，测得IC50值为175 μmol/L。

3.4 反向高效液相色谱

反向高效液相色谱法(Reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)以非极性的反相介质为固定相、极性有机溶剂或其水溶液作为流动相进行溶质的洗脱分离，利用极性较强或亲水的样品分子与反相柱中的固定相结合作用较弱而使溶质较快流出，普遍适用于分离极性、非极性或离子型化合物，具有良好的选择性。Ji W等[41]通过多步纯化得到的超滤水解产物(AKH)在IEC和RP-HPLC技术分离下，得到六肽Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Pro，其IC50为(0.93±0.05) mg/mL。

4 ACE抑制肽的鉴定和分子模拟

分离纯化后的多肽，通过对其多肽序列进行鉴定，从而筛选出有ACE抑制作用的氨基酸序列；利用降血压数据库与序列进行比对，将分子模拟技术进一步运用，找到与ACE具有高效相互作用的序列，通过计算机筛选、固相合成出序列，以进行下一步的体外活性实验。

4.1 氨基酸序列的鉴定

氨基酸序列的鉴定方法包括质谱、核磁共振、红外/紫外光谱等技术[42]。其中，质谱(Mass spectrometry，MS)是诸多鉴定蛋白质和多肽序列结构较为广泛的方法，利用样品去离子化后，以离子的质荷比不同而实现分离，再根据离子谱峰的强度差异而达到分析的目的[43-44]。Abdel-Hamid M等[45]利用高效液相色谱-串联质谱对水牛乳肽进行鉴定，分析质谱结果得到QPPQ、IPPK、FPGPIPK和IVPN等4种新型ACE抑制肽。Kim H J等[46]通过多种纯化技术，结合电喷雾电离串联质谱仪，鉴定分析得到发酵鱼酱中的4种ACE抑制肽，分别为 PK、GCK、NHP和DGGP。

4.2 多肽分子模拟

分子模拟是利用计算机以原子水平的分子模型为基础，模拟出分子体系的物理、化学特性，应用于多肽包括分子对接、分子动力学和构效分析等[47]方面的研究。

4.2.1 分子对接

ACE分子对接运用分子模拟软件，主要研究ACE与ACE抑制剂分子间的相互作用，并预测其结合模式和结构功能关系[30，48]。Shi L等[49]对ACE抑制肽NTLTLIDTGIGMTK进行分子对接，得出ACE抑制肽NTLTLIDTGIGMTK可能对ACE的残基Glu123、Glu403、Arg522、Glu376、Gln281和Asn285有抑制作用。Jalkute C B等[50]研究睾丸截短型ACE(tACE)与赖诺普利抑制剂的分子模拟，结果表明tACE的残基Ala 354、Glu 376、Asp 377、Glu 384、His 513、Tyr 520和Tyr 523通过氢键相互作用稳定作用于赖诺普利。王晓丹[51]将YS和INNQFLPYPY通过范德华力和静电力与ACE发生结合，INNQFLPYPY与ACE中部的氨基酸残基His365、Lys522和 His524发生氢键相互作用。

4.2.2 分子动力学

ACE抑制肽分子动力学反应是基于多肽与酶发生催化作用，研究酶浓度与抑制肽的反应速率。一般分为不可逆抑制和可逆抑制，可逆抑制进一步细分为竞争性、非竞争性和反竞争性抑制[52]。Zhang B Y等[53]通过分离纯化蛋清多肽，分析ACE抑制肽LAPYK的分子动力学特性，结果显示LAPYK为竞争抑制剂。Zarei M等[54]在棕榈仁蛋糕分离纯化的三条ACE抑制肽，分别为YLLLK、WAFS和GVQEGAGHYALL，应用ACE抑制肽分子动力学反应分析3条抑制肽均为混合型抑制剂。

4.2.3 构效分析

定量构效关系(Quantitative structure-activity relationship，QSAR)利用计算机数理统计模型来研究抑制肽的生物活性与分子结构的效应关系以及抑制肽在生物体内吸收、分布、代谢、排泄等生理性质。Shu M等[48]利用偏最小二乘法对58个二肽、55个三肽和50个四肽进行定量结构-活性关系模型表征，QASR的相关系数(r2)分别为0.902、0.985和0.872，交叉验证(q2)分别为0.860、0.951和0.770，结果得出ACE抑制肽序列的疏水性和空间特性在生物活性上起着重要作用。虽然ACE的构效分析并不完善，但ACE抑制肽的活性可能受其氨基酸含量影响，大部分研究也表明含疏水性的羧基端是导致ACE抑制活性的关键[55]。Qi C Y等[56]基于3D-QSAR与分子对接研究含有疏水性残基苯丙氨酸C末端的ACE抑制肽的生物活性，构建了CoMFA(q2= 0.773，r2= 0.992)和CoMSIA(q2= 0.664，r2= 0.990)模型，固相拟合了4种ACE抑制三肽GEF、VEF、VRF和VKF，通过体外活性得出IC50值分别为13、23、5和11 mmol/L，与预测值基本吻合。

5 ACE抑制肽在体内及体外活性评价

检验分离纯化的ACE抑制肽是否具有生物活性，一方面是在体外研究多肽的ACE抑制率及稳定性；另一方面通过构建原发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR) )模型，在体内进行口服灌胃、尾部静脉等实验，以血压值、血清和肺组织中的ACE活性和Ang II含量为指标，探究ACE抑制肽作用机制。

5.1 大鼠体内活性评价

ACE抑制肽体内活性研究多以SHR的血压值为指标，研究其降压活性[57]。Girgih A T等[58]将鲑鱼蛋白SPH进行RP-HPLC分离，得到SF1～SF4组分，将30 mg/kg SF3组分经大鼠口服给药2 h后，结果表明其能降低大鼠血压值(42.1 ± 3.4) mmHg。Lee J K等[29]分离纯化出3个ACE抑制合成肽(Gly-Leu-Pro、Asn-Leu-Pro、Gly-Leu-Pro)，其中Gly-Leu-Pro在体内活性和体外功能评价中均表现出降血压的生理功能。张可佳等[59]等将牡蛎ACE抑制肽灌胃大鼠的28 d实验中，第21 天 ACE抑制肽的降压效果显著优于灌胃同等质量的生理盐水，且具有良好的消化稳定性。García-Tejedor A等[60]在牛乳铁蛋白中提取ACE抑制肽，通过口服灌胃10 mg/kg多肽(DPYKLRP、PYKLRP、YKLRP、KLRP、LRP和GILRP)进行SHR血压试验，并在药理水平上研究ACE活性和Ang Ⅱ含量，结果显示DPYKLRP、PYKLRP、YKLRP和LRP均可有效降低血压20～30 mmHg，灌胃DPYKLRP和LRP的ACE活性、Ang Ⅱ含量均降低。

5.2 体外功能活性评价

体外研究检测相对于体内实验操作简单、可靠性强，研究方法主要包括紫外分光光度法、高效液相色谱法等[61]。根据反应体系，ACE抑制剂与ACE酶的活性位点相结合，阻断了Ang II 与失活片段的生成，以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)为Ang I的模拟物，HHL被ACE分解后生成马尿酸(Hippuric acid，HA)和二肽(His-Leu，HL)，通过测定HA的含量分析ACE抑制肽的体外降压活性。Cushuman D W等[61]利用紫外分光光度法，以HHL作为底物添加ACE和ACE抑制肽，通过在λ=228 nm下测定HHL的吸光值来检测ACE抑制肽的活性。Wu J等[33]利用RP-HPLC分离技术，在C18柱上将抑制肽和HHL的反应物通过三氟乙酸、乙腈和水的混合液进行梯度洗脱，定量地分析HHL和HA的峰面积。Wang Y T等[47]通过胃蛋白酶模拟体外消化系统实验，分析5个ACE抑制肽的胃肠道稳定性，其中3个二肽Gln-Trp、Cys-Tyr和Cys-Trp被消化吸收失去活性，另外2个多肽Cys-Met和Cys-Cys则可以抵抗酶的消化作用。赵玉菲等[62]研究体外环境对大海马多肽蛋白PH- I活性的影响，将PH- I分离出PH- I1～ PH- I4结果表明温度对PH-I3活性没有影响，PH-I3多肽在中性和碱性的条件下具有良好的稳定性，但在高糖、高盐下易失活。一些食源性ACE抑制肽具有较高的抑制活性，但经过人体肠胃消化分解后却没有体现出抑制作用，可能的原因之一是氨基酸序列的肽键易受外界肠胃模拟消化系统的蛋白酶水解而导致肽链断裂，从而未形成与ACE有相互作用的肽段[63]。

6 展望

ACE抑制肽日趋成为研究的热点，因其高效的降压作用，可稳定改善大鼠的高血压症状，而受到广泛关注。在体外和体内试验中进一步验证ACE抑制肽具有安全有效、无毒副作用、易消化吸收、长期服用能稳定降压等优点。近年来，随着我国高血压人群数量在不断攀升，开发食源性ACE抑制肽有利于改善服用化学合成抑制剂的高血压患者的多种不良反应。目前，ACE抑制肽在制备工艺、分离纯化技术及构效关系等领域研究较为完善，但仍有不足之处，混合肽制备降压药成本昂贵；分离纯化过程中多肽损失较多；加工环境下多肽活性难以保留，且其在胃肠消化系统中不能稳定被吸收。混合降压肽开发成为天然高效的保健食品还有待进一步探究。因此，鉴定出食源性多肽的氨基酸序列，通过ACE抑制肽与ACE的构效关系分析出高效的纯肽，在药理水平和细胞水平上对纯肽进行降压机理研究，但在保证最大程度地发挥其降压效果等方面还有待进一步研究。