封露露，贾立云，弓苗，马翠霞，封纪珍

高脯氨酸血症（hyperprolinemia）是一种先天性氨基酸代谢障碍性疾病，遗传方式为常染色体隐性遗传，脯氨酸脱氢酶（proline dehydrogenase，PRODH）与ALDH4A1基因变异均可导致脯氨酸无法转化为谷氨酸，进而参与氧化代谢，导致脯氨酸在血液中蓄积，此病在氨基酸代谢病中较为罕见，患病率尚不明确[1]。根据代谢途径中不同酶的功能缺陷，可将高脯氨酸血症分为Ⅰ型与Ⅱ型[2]。目前国外普遍采用串联质谱法及分子技术对其进行筛查和诊断，发现PRODH基因的变异可以导致脯氨酸水平异常[3-4]。石家庄市新生儿疾病筛查诊治中心从2014年开始对包括脯氨酸在内的多种氨基酸代谢病进行串联质谱筛查，对于筛查阳性患儿通过基因测序技术分析相关基因突变情况，并结合临床表现对基因突变的致病性进行研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象2014年1月—2020年12月在石家庄市县区所辖的38个助产机构分娩的172 895例活产新生儿筛查并确诊了5例高脯氨酸血症患儿，筛查需在知情同意下进行，本研究经石家庄市妇幼保健院医学伦理委员会批准并实施。

1.2 串联质谱筛查及基因测序技术

1.2.1 仪器与试剂Waters TQD液相串联质谱仪、Waters 2777C自动进样器和Waters 1525高效液相色谱仪泵；超声波清洗仪购自中国康士洁公司。恒温震荡仪购自杭州奥盛仪器公司。通风厨购自中国杰瑞电气有限公司。氨基酸检测试剂盒购自山东英盛有限公司。

1.2.2 标本采集新生儿在出生72 h后，充分哺乳8次以上，采集足跟末梢血滴于903号滤纸片上，形成至少3个直径＞8 mm圆形均匀的血斑，悬空使血液自然渗透至滤纸背面，避免重复滴血，自然晾干后置于密封袋，递送至新生儿疾病筛查中心实验室，置于冰箱冷藏，保存待检。

1.2.3 串联质谱-非衍生法打孔器打入直径3 mm的高、低质控样本和待检样本血斑于96孔萃取板，加入90 μL工作液，700 r/min，30℃，恒温震荡孵育45 min；将萃取液转移75 μL至上机板。将上机板置于Waters 2777C自动进样器中，在多反应监测模式下进行检测；用MassLynxV4.1计算待检物浓度。山东英盛有限公司提供的质控品与待检样品同时测定，质控的处理方法与样本一致，采用多批实验、最小20次质控值，计算标准偏差和均值，制作质控图。此外，每年参加国家卫生健康委员会临床检验中心的室间质量评价并合格。

1.2.4 筛查可疑阳性判定及基因测序技术初筛脯氨酸浓度＞330 μmol/L即召回，召回复查脯氨酸浓度仍＞330 μmol/L者为筛查可疑阳性患儿，需在患者家属知情同意下采用基因测序技术进行PRODH基因检测，以明确病因。知情同意下抽取筛查可疑阳性患儿静脉血（2%乙二胺四乙酸钠抗凝），提取DNA，进行基因突变分析。检测到的变异采用Sanger直接测序法进行验证，避免假阳性。

1.3 治疗及随访①限制食物中脯氨酸的摄入进行饮食治疗，降低血脯氨酸浓度。②口服抗氧化剂（维生素C、维生素E、谷胱甘肽）和维生素B6进行药物治疗，可改善癫痫症状，用药情况需结合临床。③每半年对患儿脯氨酸浓度、治疗情况及生长发育情况进行电话随访，截止至6岁。

2 结果

2.1 串联质谱筛查结果172 895例活产新生儿中筛查可疑阳性患儿10例，基因测序后确诊5例，患病率为1/34 579。例1召回复查的同时对其长兄进行采血，其长兄的脯氨酸浓度为578.83 μmol/L；例2初筛时除脯氨酸浓度升高，还合并苯丙氨酸升高（165.45 μmol/L），召回时直接进行基因测序；例3初筛时脯氨酸浓度（91.19 μmol/L）不高，因肉碱浓度低召回，复查时脯氨酸浓度为349.72 μmol/L；例4和例5初筛、复查脯氨酸浓度均＞400 μmol/L，见表1。

表1 10例筛查可疑阳性患儿血脯氨酸浓度的串联质谱结果 （μmol/L）

2.2 基因测序结果10例筛查可疑阳性患儿中基因确诊5例，基因检测结果见表2。例1为PRODH基因复合杂合突变，基因型为c.1322T＞C和c.273+1G＞C，其中c.273+1G＞C为未报道基因突变。例2为PRODH基因复合杂合突变，基因型为c.334delA和c.1322T＞C，其中c.334delA为未报道基因突变。例3检测到PRODH基因整体杂合缺失，见图1。

图1 例3 PRODH基因整体杂合缺失

表2 5例高脯氨酸血症患儿基因检测结果

2.3 5例患儿随访结果对5例患儿进行电话随访，因临床表现不明显，未给予药物治疗，部分患儿仅限制食物中脯氨酸摄入。随访截止时年龄为1岁5个月～5岁7个月，例5因随访截止时年龄较小，为1岁5个月，语言发育稍落后，需继续观察。其他患儿未出现特征性临床表现，体格及智力发育正常。例1和例4进行了短期饮食治疗，其余患儿均未进行治疗，见表3。

表3 5例患儿治疗随访情况

3 讨论

脯氨酸属人体非必需氨基酸，参与多种生物过程，如蛋白质折叠、生物大分子结构稳定及氧化还原信号的转导[5]。机体可外源性摄入脯氨酸，也可内源性通过谷氨酸或鸟氨酸途径合成。机体通过自身调节机制，控制着脯氨酸的来源和去路，使脯氨酸维持较低浓度。基因变异可引起脯氨酸代谢通路中的酶功能异常，导致先天性代谢紊乱，引起脯氨酸浓度变化，脯氨酸异常升高称为高脯氨酸血症。

随着串联质谱技术的推广应用，各地区相继开展新生儿氨基酸代谢病筛查工作，使越来越多的高脯氨酸血症患儿在新生儿早期得以检出[6-9]。目前国外利用串联质谱法及分子技术进行筛查及诊断，发现PRODH基因突变与脯氨酸水平异常密切相关。国内单独报道高脯氨酸血症的文献较少，大部分报道为遗传性代谢病筛查的总体情况，其中山东潍坊地区2013—2016年77 974例新生儿中高脯氨酸血症患病率为1/25 991[10]；浙江省2009—2016年1 861 262例新生儿中高脯氨酸血症患病率为1/310 000[11]；福建泉州地区2014—2018年364 545例新生儿中高脯氨酸血症患病率为1/364 545[12]；河南省2013—2019年850 486例新生儿中高脯氨酸血症的患病率为1/850 486[13]。本研究石家庄市172 895例新生儿中基因确诊5例，患病率为1/34 579，与山东潍坊地区患病率较接近，远高于其他地区，表明高脯氨酸血症患病率有地域性差异。

脯氨酸代谢主要与P5C还原酶、脯氨酸氧化酶（proline oxidase，POX）、P5C脱氢酶、P5C合成酶、鸟氨酸氨基转移酶和脯氨酸肽酶相关，与6种疾病相关：高脯氨酸血症Ⅰ型、高脯氨酸血症Ⅱ型、鸟氨酸氨基转移酶缺乏症、5C还原酶缺乏症、P5C合成酶缺乏症和脯氨酸肽酶缺乏症。本研究检出的患儿均为高脯氨酸血症Ⅰ型。高脯氨酸血症Ⅰ型是由POX缺陷引起，POX为线粒体内膜酶，是脯氨酸生成谷氨酸的第一个关键酶[14]，POX的编码基因是PRODH，定位于22q11.21，共含15个外显子[15]。目前已报道的PRODH基因突变有c.1279G＞A（p.V427M）、c.1357C＞T（p.R453C）、c.1414G＞A（p.A472T）、c.1562A＞G（p.Q521R）[16-18]等。本研究确诊的5例高脯氨酸血症患儿共发现4种突变，其中文献已报道2种，为c.1322T＞C和c.1363G＞T；文献尚未报道2种，分别为c.273+1G＞C和c.334delA；其中c.1322T＞C为热点突变。

高脯氨酸血症临床表现不一，大部分表现为良性病程，部分患者有不同程度的精神障碍及生长发育障碍，精神症状与高脯氨酸血症的相关性为研究热点[16,19-22]。因此，对于无症状的患儿需根据头颅磁共振成像、脑电图和血脯氨酸浓度等随访生长发育情况[2]。本研究5例患儿随访发现，除例5存在语言发育稍落后外，其他患儿各项指标发育均正常；最长的随访至5岁7个月，也未出现临床表现。因此，虽然5例患儿均检测到基因突变，然而其致病性尚不明确，需结合长期随访情况进一步研究。串联质谱技术对氨基酸代谢性疾病的早期诊断具有重要价值，应用于新生儿疾病筛查可及早检出代谢异常患儿，联合基因测序技术，可进一步诊断并明确病因，为后期临床咨询及治疗提供依据。