黄 岩，张钢强，王 锦，张 强

蚌埠医学院第一附属医院检验科，安徽蚌埠 233004

有研究表明，胃癌患者5年生存率不到30%[1]。早期胃癌缺乏特异性的临床表现，患者确诊时多处于疾病进展期或晚期阶段，这极大降低了胃癌患者的治疗效果。目前临床上用于胃癌筛查和诊断的方法主要有血清肿瘤标志物检测、内镜筛查、影像学检查、免疫组织化学检测及手术病理确诊等。其中血清肿瘤标志物检测最为安全、便捷，但是缺乏足够的灵敏度和特异度[2]，所以寻找创伤较小且特异、灵敏的胃癌筛查和诊断方法是当下临床科研工作者所面临的重要课题。前列腺素D2(PGD2)是一种脂质激素类信号配体，主要以外周组织中的免疫调节剂被熟知，比如可引起气道炎症，抑制血小板聚集及引起外周血管舒张等。近年来，PGD2的抗肿瘤作用正逐渐被重视，但其在胃癌诊断方面的报道比较少见。本研究分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)与蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胃癌患者血浆PGD2、前列腺素D2合成酶(L-PTGDS)与前列腺素D2受体(PTGDR2)表达水平，探讨血浆PGD2水平在胃癌诊断中的临床价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年5-11月在本院就诊的76例胃癌初诊患者作为胃癌组；62例胃良性病变患者作为胃良性病变组，40例体检中心体检健康者血浆标本分作为健康组。胃癌组中男55例、女21例，平均年龄(56.34±7.44)岁，有贲门癌24例、胃体癌7例、胃窦癌25例、皮革胃癌4例及位置不明胃癌16例。76例胃癌患者中56例有胃癌发病位置资料，67例有胃癌细胞分化程度资料，63例有淋巴结转移情况资料，60例有完整TNM分期资料，47例有肿瘤大小资料。胃癌的诊断通过组织病理学检查确诊，并且符合胃癌相关诊疗标准，就诊前均未接受肿瘤相关治疗。胃良性病变组中男43例、女19例，平均年龄(54.58±11.71)岁，有胃息肉32例，急性糜烂出血性胃炎10例，慢性非萎缩性胃炎20例，胃良性病变均由内镜初诊并经病理确诊排除癌前病变及癌变。健康组中男28例、女12例，平均年龄(52.98±8.57)岁。胃癌组、胃良性病变组及健康组一般资料比较，差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。本研究获得本院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1标本采集 采集受试者肘部浅静脉血3～5 mL，肝素抗凝，4 000 r/min离心4 min，取上层血浆置于小心离心管内并编号，放入-40 ℃冰箱冻存备用。收集胃癌患者手术切除的胃癌组织标本、相匹配的癌旁组织标本(距离癌组织边缘3 cm以外)及胃良性病变病患者的手术切除标本。所有组织标本均放入-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2ELISA PGD2检测ELISA试剂盒购自上海生工生物工程公司，严格按照说明书操作。使用美国BioTek公司生产的多功能酶标分析仪(MB-850)，在450 nm处测定反应孔吸光度值，通过绘制标准曲线计算PGD2水平。

1.2.3Western blot 采用Western blot检测癌组织、癌旁组织、胃良性病变组织中L-PTGDS及PTGDR2的蛋白表达水平。取出冻存的组织标本在液氮存在的条件下碾成粉末状，立即加入制备好的含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，并置于冰上裂解30 min，裂解混合物充分匀质后，以10 000 r/min、4 ℃，离心15 min，收集全部上清液，按照BCA蛋白分析试剂盒操作说明书指导的方法检测蛋白表达水平，根据标本的蛋白表达水平，取一定量的组织蛋白标本与相应的缓冲液按照一定体积比例混合后，于100 ℃沸水煮沸5 min，再加入12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。随后进行常规的转膜与封闭，再洗膜，每次10 min、洗3遍。随后加入稀释的一抗，置于4 ℃冰箱中孵育过夜。第2天取出一抗孵育过的聚偏二氟乙烯膜，使用TBS洗3遍，每次10 min，随后将聚偏二氟乙烯膜置于按一定比例稀释的二抗溶液，室温孵育2 h，按上述方式同样洗膜3次，最后利用HRP基板可视化信号显色并曝光与图像的最终采集，并用MD Image Quant Software图像分析软件进行分析并记录，最后采用内参GAPDH表达水平作为对照，L-PTGDS与PTGDR2蛋白表达水平通过以下公式来计算：L-PTGDS或PTGDR2蛋白条带的吸光度值/相应GAPDH条带的吸光度值。

2 结 果

2.1胃癌组、胃良性病变组与健康组PGD2水平比较 胃癌组血浆PGD2水平[(321.21±90.35)pg/mL]明显低于胃良性病变组[(434.02±96.14)pg/mL]和健康组[(446.75±88.29)pg/mL]，差异有统计学意义(P<0.05)，而胃良性病变组与健康组血浆PGD2水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；3组PGD2水平组间比较，差异有统计学意(F=31.64，P<0.05)。

2.2胃癌患者血浆PGD2水平与临床参数间的关系 有淋巴结转移的胃癌患者PGD2水平低于无淋巴结转移的胃癌患者(P<0.05)；细胞分化程度处于低分化的胃癌患者PGD2水平高于细胞分化程度处于中、高分化的胃癌患者(P<0.05)。血浆PGD2水平与胃癌细胞分化程度呈负相关(r=-0.279，P<0.05)。见表1。

表1 胃癌患者血浆PGD2水平与临床参数间的关系

2.3血浆PGD2水平对胃癌的诊断效能 结果显示血浆PGD2水平诊断胃癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.808，灵敏度为72.9%，特异度为81.2%，最佳临界值为350.89 pg/mL，见图1。

图1 血浆PGD2水平诊断胃癌的ROC曲线

2.4胃癌组织、癌旁组织及胃良性病变组织L-PTGDS与PTGDR2的蛋白表达水平比较 根据组织标本提取蛋白情况，最终从76例胃癌患者组织标本中筛选出符合Western blot法检测要求的癌组织及其癌旁组织25例，从62例胃良性病变患者组织中筛选出20例标本。结果显示，胃癌组织中L-PTGDS、PTGDR2蛋白表达水平低于癌旁组织及胃良性病变组织(P<0.05)，而癌旁组织与胃良性病变组织比较，L-PTGDS、PTGDR2蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表2。

图2 Western blot法分析L-PTGDS、PTGDR2的蛋白表达水平

表2 胃癌组织、癌旁组织及胃良性病变组织L-PTGDS与PTGDR2蛋白表达水平比较

3 讨 论

近年来，肿瘤干细胞(CSCs)理论的提出为肿瘤的诊疗提供了新的研究方向和切入点[3]。CSCs被认为是肿瘤组织的起始细胞，拥有高度的自我更新及分化能力[4]。其中CSCs的干性具有十分重要的意义，它与肿瘤的发生、耐药、复发、转移及上皮间质转化等多种生物学行为紧密相关[5-6]。目前临床研究已从部分肿瘤组织中分离出CSCs，如肝癌组织、卵巢癌组织、食道癌组织、乳腺癌组织及胃癌组织[7-11]。其中胃癌干细胞(GCSCs)在胃癌侵袭、转移和复发方面的重要作用已得到部分研究证实[12-13]。尽管如此，GCSCs的调控机制仍不明确，因此，更好地了解其调控相关分子及可能机制是胃癌诊疗研究中的关键。

PGD2是环氧酶催化的一个重要产物，L-PTGDS则是PGD2合成的限速酶。PGD2通过结合DP1/DP2两种膜受体而发挥生物学作用，其中DP2又名PTGDR2。目前研究不仅发现PGD2具有抗肿瘤作用，还发现PGD2与PTGDR2所组成的信号通路可能具有调控GCSCs生物学行为的潜能[14-16]，但具体机制并不明确。同时，PGD2及相关分子在胃癌临床诊疗中的价值也有待探究。ALVES等[17]的研究显示PGD2水平降低与死亡率、复发及对铂类化疗的耐药性相关，PGD2表达水平与化疗后病情进展的风险呈负相关。LIM等[18]研究表明L-PTGDS的过度表达与卵巢癌的进展有关，提示它具有成为女性卵巢癌早期诊断生物学标志物的潜在能力。SUN等[19]研究发现弥漫性大B细胞淋巴瘤中L-PTGDS低表达与不良预后相关。因此，在临床肿瘤诊断中PGD2可能具有早期筛查及指示患者预后的潜力，有必要进一步研究PGD2在胃癌诊断中的价值。

本研究结果显示，胃癌患者血浆PGD2水平降低，血浆PGD2在诊断胃癌时，有较高的灵敏度及特异度，可见血浆PGD2水平具有诊断胃癌的作用，并且还具备初步鉴别胃部病变性质的潜力。本研究还发现有淋巴结转移的胃癌患者血浆PGD2水平低于无淋巴结转移的胃癌患者，且血浆PGD2水平与胃癌细胞分化程度呈负相关(P<0.05)。低分化肿瘤细胞具有更强的侵袭性，更易发生转移和扩散，最终影响患者的生存率。因此，血浆PGD2水平检测可能具有反映胃癌患者预后的潜力。

有研究使用免疫组织化学法检测了总共277份胃癌组织标本中L-PTGDS、PTGDR2的蛋白表达水平，结果证明了胃癌组织中有L-PTGDS与PTGDR2的阳性表达[20]。于是本研究分析了胃组织中L-PTGDS与PTGDR2的蛋白表达水平，结果发现胃癌组织中L-PTGDS与PTGDR2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结合之前的研究结果推测，血浆PGD2水平降低可能与组织中蛋白表达的下调相关，该结果还提示了L-PTGDS、PGD2、PTGDR2组成的信号通路可能参与了胃癌发生过程的负调控[20]，进一步研究其下游调控机制显得尤为必要。

综上所述，胃癌患者血浆PGD2水平低于胃良性病变患者和体检健康者，血浆PGD2水平检测对胃癌的诊断具有一定的临床价值；血浆PGD2水平与胃癌分化程度呈负相关，可协助临床对胃癌患者预后的判断。本研究可为进一步开展PGD2/PTGDR2信号通路相关蛋白参与胃癌发生发展的机制研究提供临床基础。但本研究仍存在局限性，如样本数量较少，临床资料不齐，分组统计不够详细；入组病例的排除条件不够细致；只做了回顾性分析而缺少前瞻性研究，如复发、转移及生存期的相关分析。以上这些均是将来需要继续努力探索的方向。