朱乐欣，古 云，王军兆，方 春，蒋小武

（1.宜春学院医学院，宜春 336000；2.长江大学动物科学学院，荆州 434025）

猪链球菌（Streptococcus suis, S. suis）是一种人畜共患的革兰氏阳性球菌，可感染人畜诱发败血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎以及严重的炎症因子风暴[1-3]。我国于1998年和2005年在江苏和四川暴发了两次猪链球菌感染公共卫生事件，造成大量的猪群和多人患病死亡[4-5]。根据细菌荚膜多糖（capsular polysaccharides,cps）的多样性，猪链球菌至少分成35个血清型（1-34，1/2），国内外流行率与发病率较高是猪链球菌2型[6-7]。

猪链球菌疫苗是防控猪链球菌感染的关键，尤其是可提供交叉保护多种感染性血清型的通用疫苗已成为当下猪链球菌疫苗研发的热点与难点[8]。活疫苗具有保护性稳定、生产成本与副作用低等优势，但由于猪链球菌2型致病性强，分布广泛，直接使用2型猪链球菌作为活疫苗候选株存在返强的潜在风险[8-9]。课题组前期分离获得一株非2型猪链球菌HN152菌株，经血清型鉴定为31型[10]。本研究旨在分析猪链球菌31型HN152菌株的相关生物学特征、致病效应及其对猪链球菌2型强毒株感染的交叉保护作用。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂猪链球菌2型HA9801菌株由浙江大学方维焕教授馈赠；脑心浸出液（BHI）购自OXOID公司；PCR扩增酶与克隆试剂购自北京全式金生物技术有限公司；DMEM或1640基础细胞培养液、双抗及胎牛血清FBS等购自Gibico公司；BALB/c小鼠购自上海斯莱克公司；HRP标记羊抗鼠IgG购自天津三箭生物技术股份有限公司；LIVE/DEAD细胞毒性检测试剂盒购自Invitrogen公司；乳酸脱氢酶活性检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；ECL发光底物试剂盒购自Thermo公司；HEp-2与bEND3.0细胞为本实验室保存。

1.2 猪链球菌31型HN152菌株血清型特异基因与毒力基因鉴定水煮法提取HN152与HA9801细菌基因组，保存备用。NCBI检索猪链球菌31型荚膜多糖基因cps31L与猪链球菌传统毒力标志因子MRP、SLY、EF核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，PCR扩增相应基因片段。对cps31L基因扩增产物进行TA克隆、测序，以DNAStar软件进行同源性比对。相关引物序列见表1。

表1 PCR扩增反应引物Table 1 Primers used in this study

1.3 黏附试验参考文献[11]报道的方法进行猪链球菌细胞黏附试验。HEp-2细胞以2.0×105个/孔的密度接种至含10%FBS的DMEM培养基的24孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养10 h。挑取HA9801与HN152单菌落于BHI液体培养基中，37℃培养12 h，离心收集菌体，并以10 mmol/L PBS洗涤2次，调节细菌悬浊度OD600至0.4，倍比稀释法进行细菌计数。取出HEp-2细胞，加入预热的10 mmol/L PBS洗涤1次。以感染比（MOI=100:1）加入细菌悬液与细胞完全培养液，轻轻摇匀，300 ×g离心5 min，置于37℃、5%CO2培养箱中作用2 h。取出培养板，10 mmol/L PBS洗涤4次，除去胞外游离未黏附细菌。孔内加入1 mL ddH2O，室温放置10 min，待细胞裂解后，收集裂解液，振荡混匀并进行梯度稀释，接种于BHI平板上，37℃过夜培养，并进行黏附菌计数。每种处理重复3个孔，黏附试验重复3次，黏附率计算公式为：黏附率（%）=（胞内细菌数+胞外细菌数）/加入孔内的细菌数×100%。黏附拮抗试验步骤同本法，不同之处在于SS2感染菌HA9801需要预先以10%灭活的HN152小鼠高免血清与免前血清37℃处理0.5 h，设置无血清PBS处理对照。

1.4 细胞毒性检测小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd3.0细胞以2.5×105个/孔的密度，接种于24孔板中，37℃、5%CO2条件下培养至细胞融合度90%左右备用。以MOI为100∶1加入不同细菌悬液，并同时设置PBS与0.2%Triton X-100处理作为阴性与阳性对照。37℃培养2 h，收集不同感染细胞上清液，以乳酸脱氢酶活性检测试剂盒（LDH Cytotoxicity Assay Kit）检测细胞毒性。孔内细胞以PBS洗涤2次，加入LIVE/DEAD细胞毒性荧光染料暗室作用5 min，荧光显微镜下观察活细胞与死细胞的相对比例。

1.5 小鼠致病性分析挑取HA9801与HN152单克隆于BHI培养液中，37℃摇床培养过夜，离心收集菌体，PBS重悬。将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成3组，每组10只，分别以HA9801绝对致死量（约1.0×109CFU/mL）当量的菌液腹腔接种于小鼠体内，1 mL/只，阴性对照组注射无菌PBS。各试验组小鼠隔离饲养，每天给予充足的饮水和饲料，每隔半天观察小鼠的发病特征，记录死亡情况，连续观察1周。统计各组小鼠存活率，并采用Graphpad软件绘制存活曲线。

1.6 免疫保护试验参考文献[12]方法进行小鼠模型免疫保护试验。随机选取5周龄雌性BALB/c小鼠36只，分成3组（分别为免疫组、未免疫组和空白组），每组12只。各组分别接种2次（首免与二免间隔时间为2周），其中免疫组小鼠皮下接种猪链球菌31型HN152活菌（约1.0×108CFU/mL），未免疫组与空白对照组分别接种等量的PBS，每只小鼠接种量为1 mL。14 d后各组小鼠加强免疫一次。加强免疫第10 d（即24 d）时，对各组小鼠进行攻毒试验，攻毒菌株为猪链球菌2型强毒株HA9801，接种剂量为1×109CFU/mL。每天早晚观察2次，持续1周，记录小鼠发病情况和病死数，绘制小鼠存活曲线。整个试验过程中，各组小鼠首免前、14 d加强免疫前及24 d攻毒前分别进行眼眶采血，收集血清。以HN152全菌作为包被抗原（100 μg/孔），以首免前血清作为阴性对照血清，PBS作为空白对照，ELISA方法测定不同时间点免疫小鼠抗体效价变化。

1.7 血清交叉反应性分析采用参考文献[13]的方法提取猪链球菌表面蛋白。收集对数生长期的HA9801与HN152菌体，PBS洗涤2次，加入1 mL猪链球菌表面蛋白提取液（配方为30 mmol/L Tris-HCl，pH7.5；2 mmol/L MgCl2；25%R: sucrose；3 mg/mL lysozyme；5 mmol/L PMSF），37℃水浴孵育1 h，4℃条件下12 000×g离心10 min，上清液即为猪链球菌表面蛋白提取物。BCA法定量提取物蛋白浓度。上样10 μg的HN152和HA9801表面蛋白进行SDS-PAGE，电泳条件为80 V，0.5 h，120 V，1.5 h。跑胶后进行湿法转膜，转膜条件为30 V，16 h。取出PVDF膜，以5%脱脂奶粉的TBST溶液37℃封闭2 h，TBST洗涤3次。加入一抗，抗体为不同时间点（0、14 d和24 d）收取的HN152小鼠抗血清，血清稀释倍数为1∶200，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。加入羊抗鼠HRP标记抗体（1∶2000），37℃孵育1 h，TBST洗涤5次，再进行ECL曝光，分析HN152活菌免疫小鼠血清与菌体表面蛋白的反应性。

2 结果

2.1 猪链球菌31型HN152菌株不含毒力因子SLY、MRP与EF为确证实验室分离获得的猪链球菌菌株HN152是否为31型，进行血清型特异基因cps31L检测，PCR结果显示HN152菌株cps31L阳性，其与已公布的其他菌株对应核苷酸序列同源性为99.4%，HN152菌不含传统毒力标志因子（即Sly-MRP-EF-）（图1）。

图1 HN152菌株cps31L基因与毒力因子鉴定Fig.1 cps31L and virulence gene identification in HN152 strain

2.2 HN152菌株黏附力高为分析HN152的感染特征进行体外细胞黏附试验。结果显示：HN152菌株对上皮细胞黏附力强，黏附力是2型猪链球菌HA9801的3.4倍，差异极显著（P＜0.01）（图2），具有统计学意义。

图2 黏附试验Fig.2 Adherence assay

2.3 HN152菌株致病性低体外细胞感染试验检测不同菌株处理的细胞毒性发现：猪链球菌31型HN152感染bEND3.0细胞病变不明显，与PBS对照组细胞形态基本一致，细胞活性定量检测分析发现死亡细胞比例极低，与对照组差异不明显（P＞0.05），而HA9801强毒菌株诱导细胞肿胀、破裂，2 h时大部分细胞形态不完整，定量分析死亡细胞达56.8%，这说明HN152的细胞毒性极显著低于高致病2型菌株HA9801（图3A，3B）。小鼠感染模型结果显示：SS2-HA9801感染组小鼠12 h左右即出现扎堆、被毛凌乱、行动迟缓与精神萎靡等临床症状，2 d内小鼠完全死亡，剖检发现有典型的败血症与脑膜炎症状；而SS31-HN152感染组小鼠症状轻微，脏器病变

不明显，没有出现小鼠死亡（图3C）。上述体内、体外致病性试验结果说明：猪链球菌HN152菌株致病性极低，具备活疫苗载体的基本特质，可用于进一步分析其免疫保护作用。

图3 HN152致病性分析Fig.3 Pathogenicity assessment of HN152 strain

2.4 HN152活菌免疫介导交叉保护SS2感染BALB/c小鼠经HN152活菌皮下免疫2次，血清中HN152全菌抗体效价可达1∶12 800倍以上（图4A），免疫印迹结果说明HN152全菌有效刺激机体产生了相应抗体（图4B）。攻毒保护试验发现：未免疫对照组小鼠完全死亡，而HN152菌株免疫组小鼠仅死亡1只，存活率达91.7%，说明HN152活菌免疫可保护小鼠抵抗猪链球菌2型强毒株HA9801的感染（图4C）。为分析HN152活菌跨血清型保护2型猪链球菌感染的原因，进行免疫血清交叉反应试验，发现：HN152活菌首免血清即可与SS2菌株表面蛋白发生交叉反应，加强免疫的血清与SS2菌株表面蛋白结合的种类与丰度均更高（图4C），这暗示SS31-HN152与SS2-HA9801两株菌存在许多共有表面抗原。以HN152活菌免疫产生的抗体预处理SS2感染菌，发现处理后的细菌对上皮细胞的黏附力明显下降，这说明HN152活菌免疫可有效抵御SS2强毒菌的黏附效应（图4D）。

图4 免疫保护作用分析Fig.4 Immuno-protection assay

3 讨论

血清2型是猪链球菌分布最广与毒力最强，是目前暴发过人兽共患严重公共卫生事件的血清型[6,14]。疫苗是防控细菌性传染病的主要手段之一，但现有的猪链球菌疫苗存在很多弊端。常用的猪链球菌2型灭活苗往往需要多次免疫，副作用大，免疫保护效果不稳定，对非2型流行性血清型感染常常无效，大量的亚单位疫苗候选抗原被筛选出来，但普适性差，对不同地域或血清型间的强毒菌株防御效果差异很大，离商品化还有一定距离[8,15-16]。筛选高效安全、生产成本低且可跨血清型介导交叉保护作用的非2型猪链球菌活疫苗候选株，成为猪链球菌疫苗研制的方向之一。

本研究成功鉴定获得了一株猪链球菌31型的HN152活疫苗候选株，该菌低毒、不含相关毒力标记因子，可介导交叉保护SS2强毒株的感染。HN152高免血清与SS2表面蛋白有较好的交叉反应性，两个血清型对应的菌株存在共有表面抗原，这些保守性表面抗原有效诱导机体形成的抗体可能是介导小鼠抵抗SS2感染的关键因素。另外，黏附作用是细菌与宿主互作的关键步骤，SS2通过黏附作用定植在宿主细胞表面，强毒菌株可突破屏障诱发更深层次的感染，而弱毒株则依赖该过程诱导宿主免疫反应[14,17-18]。本研究发现HN152活菌免疫形成的高免血清可以抑制SS2感染菌的黏附作用，降低强毒株的致病效应，而且HN152活菌本身致病性极低，黏附力强，这将有力促进活菌持续刺激机体产生特定免疫反应。关于HN152活菌对其他非2型流行性血清型的免疫保护作用，挖掘其与猪链球菌2型的共有免疫原蛋白及其在仔猪模型上的保护效应是下一步研究的重点。