刘待见，刘剑波

郑州大学第二附属医院呼吸科 郑州 450014

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统常见病，可以引起肺部严重病变，同时具有显著的肺外(全身)影响[1]，其中骨骼肌萎缩伴功能障碍是重要表现之一。在COPD病程中，骨骼肌萎缩出现早，发生率高，严重影响患者的生活质量及预后，但目前COPD患者骨骼肌萎缩发生机制不明确，治疗措施有限。研究[2-4]表明骨骼肌萎缩发生机制复杂，已发现多种代谢途径参与，其中钙蛋白酶(Calpain)途径和泛素-蛋白酶途径是研究较为广泛的途径。Calpain途径可拆卸肌原纤维成为肌丝片段，从而启动肌纤维蛋白降解；泛素-蛋白酶体途径可将较大的蛋白质肽链彻底水解为小的肽段或者游离氨基酸。两个途径均属于蛋白降解系统，通过降解蛋白，有序参与肌纤维蛋白降解，是参与骨骼肌萎缩的重要途经。本课题组前期研究[5-6]发现，Calpain及其内源性抑制剂Calpastatin在COPD大鼠骨骼肌中表达增强，可能参与骨骼肌萎缩。本研究通过外源性Caplain抑制剂干预，进一步研究Calpain途径在COPD大鼠骨骼肌萎缩中的作用以及对泛素-蛋白酶体途径的影响，为防治COPD骨骼肌萎缩提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料48只10周龄SPF级大鼠，体重(218.5±16.9) g，由河南省实验动物中心提供；红旗渠牌香烟(河南中烟工业公司安阳卷烟厂，烤烟型，焦油量13 mg，CO量13 mg，烟气烟碱量1.1 mg )，猪胰弹性蛋白酶、DMSO、26S蛋白酶体抑制剂(MG-132)及底物(美国Sigma公司)，Calpeptin(德国Merck Millipore公司)，Bradford蛋白定量试剂盒、反转录试剂盒(郑州迈思生物科技有限公司)，Calpain活性荧光检测试剂盒(美国Biovision公司)。

1.2 模型制备及动物分组适应环境1周后，按随机数字表法将48只大鼠分为模型组(30只)、健康对照组(18只)。造模第1～29天、第31～60天，将模型组大鼠置于烟雾染毒箱(80 cm×60 cm×58 cm)内行香烟烟雾刺激(分2次点燃香烟，10支/次，30 min/次)，2次/d；健康对照组不做任何干预。第30天，将猪胰弹性蛋白酶200 U/kg注入模型组大鼠气管内；将等量生理盐水注入健康对照组气管内。造模结束后，分别在模型组和健康对照组随机选取6只大鼠行肺通气功能测定，处死并留取大鼠肺、趾长伸肌(extensor digitorum longus，EDL)标本行病理检查。模型组剩余大鼠再按照随机数字表法分为Calpeptin干预组和阴性对照组，各12只。Calpeptin干预组小鼠肌内注射0.2 mL Calpeptin，剂量2 mg/(kg·d)，连续4周；同时，阴性对照组给予DMSO 0.2 mL。干预后1周、4周分别处死6只大鼠。具体分组见图1。

图1 实验动物分组

1.3 肺通气功能测定大鼠麻醉后备皮，分离气管，水平剪开气管，置入Y型管，接呼吸换能器，测量最大呼气流速(PEF)、用力呼气容积(FVC)、第0.3 s用力呼气容积(FEV0.3)，计算FEV0.3/FVC。

1.4 标本收集急性失血法处死大鼠，完整分离大鼠左右两侧EDL，称重并记录，左侧EDL分成两部分，一部分置于40 g/L多聚甲醛中固定，待病理学检测，另一部分投入液氮罐中冻存以备RT-PCR、蛋白酶活性检测。40 g/L多聚甲醛液经右心室冲洗双肺至表面颜色变白，分离右肺，在与支气管垂直的截面最大周径处留取肺组织标本，放入40 g/L多聚甲醛中固定。

1.5 组织病理学检测肺组织和EDL组织固定24 h以上，石蜡包埋，切片，HE染色，阅片，留图。

1.6 大鼠EDL中Calpains、肌肉萎缩盒F蛋白(Atrogin-1)、肌肉环状指蛋白1(MuRF-1) mRNA表达的RT-PCR检测取EDL约50 mg至研钵内，加液氮研磨，加入1 mL Trizol提取总RNA，进行RNA 含量检测。严格遵照试剂盒说明进行PCR操作。m-Calpain上游引物5’-CATTTGACTGAC CAACTGAGCC-3’，下游引物5’-ACGTTTGGAAGT GGATAAGGCA-3’，扩增产物大小188 bp。μ-Calpain上游引物5’-TCCCTCTGCAAACCAAAGTACA-3’，下游引物5’-ACTGCACTGAAACATGGGACCT-3’，扩增产物大小207 bp。Atrogin-1上游引物5’-AGTGAAGACCGGCTACTGTGGAA-3’，下游引物5’-TTGCAAAGCTGCAGGGTGAC-3’ ，扩增产物大小176 bp。MuRF-1上游引物5’-GGGAACGAC CGAGTTCAGACTATC-3’，下游引物5’-GGCGT CAAACTTGTGGCTCA-3’，扩增产物大小108 bp。GAPDH上游引物5’-CACGGCAAGTTCAACGGCA CA-3’，下游引物序列5’-GCGGCATGTCAGATCCA CAACG-3’，扩增产物大小588 bp。产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，置于紫外透射仪(暗箱式)中成像，BandScan凝胶电泳图像分析软件处理数据，以GAPDH为内参，计算目的条带与内参灰度值比值。

1.7 EDL中Calpain活性的测定将约50 mg EDL剪碎，置入1.5 mL EP管中，加入预冷的裂解液，高速匀浆，0 ℃静置15 min。4 ℃，12 000 r/min离心30 min，收集上清液，严格按照Calpain活性荧光检测试剂盒说明书操作。

1.8 EDL中26S蛋白酶体活性测定取50 mg EDL组织，按照操作规范进行蛋白提取，并采用BCA法进行蛋白定量，在黑色荧光检测专用96孔板中进行，先后加入分析缓冲剂、样品、抑制剂、底物后，进行荧光检测。实际读数=(样品读数-背景对照读数)÷蛋白含量÷检测时间。

1.9 统计学处理采用SPSS 23.0分析数据，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较健康对照组、Calpeptin干预组和阴性对照组(3组)大鼠EDL质量和EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA的表达以及Calpain、26S蛋白酶体活性的差异，Pearson直线相关分析阴性对照组和Calpeptin干预组大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表达的相关性以及Calpain活性与26S蛋白酶体活性的相关性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠肺通气功能比较见表1。与健康对照组比较，模型组大鼠PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC值均下降，提示COPD模型构建成功。

表1 大鼠肺通气功能比较

2.2 3组大鼠EDL质量比较见表2。Calpeptin干预组和阴性对照组EDL质量较健康对照组减轻，Calpeptin干预组EDL质量较阴性对照组稍增加。

表2 3组大鼠EDL质量比较 mg

2.3 3组大鼠肺组织及EDL组织病理学比较见图2。阴性对照组大鼠肺组织可见炎症细胞浸润，黏膜柱状上皮细胞部分缺损、纤毛减少，腺体增生，肺泡结构破坏，部分形成大疱；EDL结构松弛，肌纤维萎缩，并见细胞变性坏死。健康对照组大鼠肺组织及EDL组织形态规则、结构完整。Calpeptin干预组大鼠肺组织及EDL组织病理损伤较阴性对照组减轻；4周和1周比较，Calpeptin干预组大鼠肺组织及EDL组织病理损伤均减轻。

A：健康对照组；B：阴性对照组；C：Calpeptin干预组1周；D：Calpeptin干预组4周；1：肺组织；2：EDL组织

2.4 3组大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA的表达见图3、表3。与健康对照组比较，Calpeptin干预组和阴性对照组大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA的表达均增强；Calpeptin干预组大鼠上述mRNA的表达均低于阴性对照组。

表3 3组大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA的表达

2.5 3组大鼠EDL中Calpain、26S蛋白酶体活性的比较见表4。与健康对照组比较，阴性对照组和Calpeptin干预组大鼠EDL中Calpain、26S蛋白酶体活性增强；与阴性对照组比较，Calpeptin干预组大鼠EDL中Calpain、26S蛋白酶体活性减弱。

A：健康对照组；B：阴性对照组；C：Calpeptin干预组；1：1周；2：4周

表4 3组大鼠EDL中Calpain、26S蛋白酶体活性

2.6 相关性分析见表5、6。阴性对照组和Calpeptin干预组大鼠EDL中Calpain mRNA与Atrogin-1 mRNA、MuRF-1 mRNA的表达及26S蛋白酶体活性均呈正相关。

表6 Calpain活性与26S蛋白酶体活性的相关性分析结果

3 讨论

COPD是临床常见病。骨骼肌萎缩伴功能障碍是COPD常见不良反应，即使轻中度COPD患者亦存在骨骼肌功能障碍，晚期COPD患者多数有严重骨骼肌萎缩，是COPD患者活动能力下降和死亡的主要原因之一。骨骼肌萎缩发生机制复杂，有研究[7]证实肌纤维蛋白降解加速是骨骼肌萎缩发生的重要原因；肌纤维蛋白降解由多种代谢途径参与，其中Calpain途径和泛素-蛋白酶体途径是两个重要途径。Calpain途径由Calpain、内源性钙蛋白酶抑制剂和钙蛋白酶激活蛋白组成，Calpain是底物蛋白水解酶，内源性钙蛋白酶抑制剂和钙蛋白酶激活蛋白主要对Calpain起调节作用。μ-Calpain和m-Calpain是该途径最重要的两种Calpain，两者通过降解骨架蛋白和肌原纤维蛋白，拆卸肌纤维，释放出肌丝片段[8]，最终肌丝片段被泛素-蛋白酶体等途径水解为游离氨基酸或者肽段。泛素-蛋白酶体途径主要包括泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、泛素解聚酶(DUB)、26S蛋白酶体等。该途径包括两个步骤：泛素化和26S蛋白酶降解被泛素化的底物蛋白。Atrogin-1及MuRF1是泛素-蛋白酶体途径中最重要的E3连接酶，在肌纤维蛋白降解中决定泛素化过程的特异性[9]；26S蛋白酶体执行泛素-蛋白酶体途径最后一步，将肌丝片段降解为游离氨基酸或者肽段，由此可见Atrogin-1、MuRF1、26S蛋白酶体均是泛素-蛋白酶体途径中具有代表性的组分。Maltais等[10]报道，COPD患者骨骼肌中活性氧增加，引起泛素-蛋白酶体途径激活，加速COPD肌肉蛋白降解。有研究[11]发现，骨骼肌萎缩组的COPD患者骨骼肌中Atrogin-1与MuRF-1的表达明显升高，提示COPD患者骨骼肌蛋白水解增加。可见在COPD骨骼肌萎缩过程中，Calpain途径和泛素-蛋白酶体途径均起重要作用。

抽烟及蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD的主要致病原因，故本研究采用反复香烟烟雾刺激并猪胰弹性蛋白酶滴入气道内法制备COPD大鼠模型[12]。本研究旨在观察Calpeptin对COPD大鼠骨骼肌中Calpain的抑制作用。本研究结果显示，阴性对照组大鼠EDL质量减轻，存在EDL萎缩，Calpeptin干预组大鼠EDL质量较阴性对照组增加，EDL组织萎缩减轻，提示Calpeptin可以减轻COPD骨骼肌萎缩。阴性对照组大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1及MuRF-1 mRNA表达增强，Calpain活性及26S蛋白酶体活性增强，提示COPD大鼠EDL中Calpain途径及泛素-蛋白酶体途径被激活，肌肉蛋白降解增加。Calpeptin干预后，Calpeptin干预组较阴性对照组大鼠EDL中Calpains mRNA表达减弱，Calpain活性减弱，提示Calpeptin可以抑制Calpains的表达及活性，同时发现泛素-蛋白酶体途径中重要组分Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表达减弱及26S蛋白酶体活性减弱，且与Calpain mRNA的表达及Calpain活性相关；提示Calpeptin可以通过抑制Calpains的表达及活性，减弱泛素-蛋白酶体途径激活，减轻COPD大鼠骨骼肌萎缩。

综上，本研究结果显示Calpeptin可以抑制COPD大鼠骨骼肌萎缩，为临床治疗COPD骨骼肌萎缩提供新的思路和理论依据。有研究[13]显示，Calpain抑制剂Calpeptin可以减弱香烟烟雾诱导的肺部炎症；Zhu等[14]发现Calpain抑制剂MDL28170可减弱COPD大鼠气道阻力、右心室收缩压以及支气管和肺动脉平滑肌增生，减轻肺气肿，提示Calpain抑制剂不仅可以减轻骨骼肌萎缩，同时可以保护COPD肺组织，抑制气道及肺血管重塑。鉴于Calpain抑制剂对COPD肺组织及骨骼肌的双重保护作用，未来有待发掘可以应用临床的Calpain抑制剂。