丁润蓉，孙华磊，刘亚萍，张玉晶，李 星，李文杰

郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一种常见的代谢性疾病；国际糖尿病联盟报告，截至2019年，全世界有超过4.63亿糖尿病患者，预计到2045年将上升到7亿[1]。有研究表明[2]糖尿病肾病是一种常见的糖尿病慢性微血管并发症，是导致终末期肾病的最常见原因，其详细机制至今仍不清楚；目前有研究[3]表明炎症介质与糖尿病肾病的发展密切相关。在高糖环境下，糖脂代谢紊乱、血流动力学改变等因素刺激可以激活肾脏炎症反应，使得细胞外基质过度沉积，引起肾小球硬化、肾间质纤维化，最终导致肾功能丧失[4]。Wu等[5]认为抑制炎症及成纤维细胞的激活可能是延缓糖尿病肾病进程的有效手段。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是存在于蓝莓等浆果中的一种天然多酚类化合物，具有抗炎、抗糖尿病等作用[6]。张玉晶等[7]发现PTE可以改善T2DM大鼠肝脏炎症反应，减轻肝损伤，但其对肾脏损伤的研究比较少见。本研究观察了PTE对T2DM大鼠肾损伤的改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料4周龄SPF级雄性SD大鼠60只，购自河南省实验动物中心(动物许可证号：SCXK2015-0004)。PTE购自上海士丰生物科技有限公司；尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)测定试剂盒购自中生北控生物科技有限公司。NF-κBp65、TGF-β1多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，α-SMA多克隆抗体购自博士德生物工程有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒、GAPDH多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 T2DM大鼠动物模型的建立和分组将60只SD大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法选择其中10只作为正常对照组，剩余50只喂养高脂高糖饲料。大鼠高脂高糖喂养4周后，按照40 mg/kg的剂量一次性腹腔注射10 g/L链脲佐菌素溶液，并在注射后的第3天和第7天测定大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，2次FBG≥16.7 mmol/L且出现多饮、多食、多尿症状提示T2DM造模成功。将造模成功后的大鼠采用随机数字表法分为5组，即T2DM对照组，低、中、高剂量PTE组和罗格列酮组。将PTE和罗格列酮溶于羧甲基纤维素钠溶液。低、中、高剂量PTE组分别按照20、40、80 mg/kg的剂量灌胃，罗格列酮组按照5 mg/kg的剂量灌胃，正常对照组和T2DM对照组大鼠给予等体积的羧甲基纤维素钠溶液灌胃，1次/d，连续6周。6周后，经腹主动脉采血备用；处死大鼠后留取肾脏。

1.3 各组大鼠FBG和血清中TG、TC、BUN的测定全自动生化分析仪检测FBG、TG和TC的水平；脲酶法测定血清中BUN的水平，检测方法遵循试剂盒说明书。

1.4 各组大鼠肾组织形态学观察取肾组织，PBS清洗，用40 g/L多聚甲醛溶液固定，然后用石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察。

1.5 各组大鼠肾组织中NF-κBp65、TGF-β1、α-SMA蛋白表达水平的Western blot法检测称取肾组织0.1 g，加入组织蛋白抽提试剂提取蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，然后采用5×SDS蛋白电泳上样缓冲液将蛋白变性。每个泳道上样量为50 μg，电泳、转膜；用50 g/L脱脂奶粉液封闭90 min；加一抗(GAPDH、TGF-β1和α-SMA多克隆抗体按1∶5 000稀释，NF-κBp65多克隆抗体按1∶500稀释)4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，10 min/次；加入二抗(按1∶5 000稀释)，室温下孵育2 h，TBST清洗3次，10 min/次。ECL发光液显影，扫描结果后，用Image J软件分析。

1.6 统计学处理采用SPSS 25.0分析实验数据。应用重复测量数据的方差分析比较各组大鼠干预前后FBG、血脂水平变化，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组大鼠血清BUN、肾组织中NF-κBp65、TGF-β1、α-SMA蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG、血脂水平的变化见表1。由表1可知，T2DM对照组，低、中、高剂量PTE组大鼠FBG，血清TC、TG水平均高于正常对照组(P<0.05)。干预6周后，低、中、高剂量PTE组以及罗格列酮组大鼠FBG，血清TC、TG水平均较干预前下降，但其水平仍高于正常对照组(P<0.05)。与T2DM对照组相比，低剂量PTE组和罗格列酮组大鼠血清TC、TG水平较低(P<0.05)。

表1 各组大鼠FBG、血脂水平的变化(n=10) mmol/L

2.2 各组大鼠血清中BUN，肾组织中NF-κBp65、TGF-β1、α-SMA蛋白表达的比较见表2。与正常对照组相比，T2DM对照组，低、中、高剂量PTE组以及罗格列酮组血清中BUN值较高(P<0.05)。与T2DM对照组相比，低、中、高剂量PTE组以及罗格列酮组大鼠血清BUN水平下降(P<0.05)，且高剂量PTE干预效果最显著。与正常对照组相比，T2DM对照组大鼠NF-κB、TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平升高(P<0.05)。与T2DM对照组相比，低、高剂量PTE组和罗格列酮组NF-κB蛋白表达水平降低(P<0.05)；中、高剂量PTE组和罗格列酮组TGF-β1蛋白表达水平降低(P<0.05)；低、中、高剂量PTE组和罗格列酮组α-SMA蛋白表达水平降低(P<0.05)。其中低剂量PTE组NF-κB和α-SMA蛋白表达的干预效果最显著，且随着PTE干预剂量的增加，TGF-β1蛋白表达水平逐渐降低。

表2 各组大鼠血清中BUN，肾组织中NF-κBp65、TGF-β1、α-SMA蛋白表达的比较(n=10)

2.3 各组大鼠肾组织形态学表现见图1。正常对照组大鼠肾小球和肾小管结构清晰可见，系膜基质分布正常，无纤维化(图1A)。T2DM对照组大鼠可见部分肾小管上皮细胞出现水肿或空泡变性，肾小管间质炎性细胞浸润，纤维细胞增生，基底膜弥漫增厚(图1B)。与T2DM对照组相比，PTE低、中剂量PTE组肾脏组织系膜细胞轻度增生，系膜基质扩张减轻，基底膜增厚改善，肾小管间质炎性细胞浸润减少(图1C和D)；高剂量PTE组基底膜增厚明显改善，且未观察到明显的炎性细胞浸润(图1E)。罗格列酮组肾组织形态明显改善(图1F)，与正常对照组较为接近。

A：正常对照组；B：T2DM对照组；C：低剂量PTE组；D：中剂量PTE组；E：高剂量PTE组；F：罗格列酮组

3 讨论

糖尿病肾病一种严重的肾脏疾病，以肾小球肥大、炎性细胞浸润和肾组织纤维化为病理特征[8]。目前，高脂高糖联合STZ诱导的糖尿病大鼠模型已被广泛用于研究早期糖尿病肾脏变化。本研究中，作者采用PTE对高脂高糖联合STZ诱导的糖尿病大鼠进行了为期6周的干预。结果表明，T2DM对照组大鼠FBG水平升高，血清中TG、TC、BUN水平均升高，肾脏有明显的炎性细胞浸润，并伴有纤维化，提示T2DM大鼠肾功能受损。而PTE干预可以降低T2DM大鼠FBG、血脂以及BUN水平，改善肾脏的组织病理学变化。

糖脂代谢紊乱在糖尿病肾病中发挥重要作用，持续高糖刺激可激活肾脏炎症反应，而慢性炎症可导致纤维连接蛋白、细胞因子和生长因子的合成，加速肾小球硬化和肾小管间质纤维化的进程，进而加重糖尿病肾病[9]。炎症因子NF-κB是糖尿病肾病发展中独特的转录因子，在糖尿病肾病的炎症和纤维化过程中发挥重要作用[10]。彭艳芳等[11]发现PTE可以降低NF-κB的水平，减轻炎症反应，进而减轻博莱霉素导致的大鼠肺纤维化。本研究结果显示，T2DM模型组大鼠肾脏有炎性细胞浸润，且肾脏组织NF-κB蛋白表达水平升高，而经PTE干预后，肾脏组织炎性细胞浸润减少，NF-κB蛋白表达水平降低，说明PTE可能通过抑制NF-κB活性来减轻T2DM大鼠肾脏炎症。

TGF-β1是公认的调节肾脏纤维化过程的关键因子，可以诱导肾小管上皮间充质转化，导致细胞外基质产生增多，促进肾脏纤维化[12-13]。有研究[14]显示，NF-κB有TGF-β1的结合位点，活化的NF-κB可以诱导其下游基因TGF-β1的表达，促进肾纤维化的进程。TGF-β1还可以诱导成纤维细胞转化为活性的肌成纤维细胞，进一步导致纤维化标志物α-SMA的过度表达。研究[15]发现，抑制TGF-β1信号通路的表达可减轻肾脏纤维化反应。本研究结果显示，T2DM模型组大鼠基底膜增厚，系膜细胞增生，肾脏组织中TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平升高，而PTE干预后，T2DM大鼠肾脏病理结构明显改善，TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平降低，与报道一致。本实验结果显示，PTE可减少炎症因子NF-κBp65的表达以及细胞外基质蛋白如TGF-β1和纤维化标志物α-SMA的积累，进一步证明了PTE在STZ诱导糖尿病大鼠模型中具有改善肾功能和对肾纤维化的治疗作用。

综上所述，PTE可以改善T2DM大鼠肾脏的损伤，减轻炎症及纤维化反应。其具体机制可能与抑制NF-κB/TGF-β1信号通路有关，为治疗糖尿病肾病提供了新思路。