赵 展，王晓婷，李 林，侯晟灿，霍治邦，张新成

（1.开封市农业物联网工程技术中心·河南省高标准农田智能灌溉工程研究中心·开封大学信息工程学院河南开封 475004； 2.开封市农林科学研究院 河南开封 475004）

西瓜是我国重要的蔬菜型水果，因其品质好、瓤质细、抗病强等特点而深受消费者和生产者的喜爱和信赖，具有很重要的经济价值。但在西瓜长期育种过程中，由于育种目标大多单一，使得西瓜种质资源的遗传基础越来越狭窄，进而使西瓜的产量、品质等重要性状在生产上均受到较大限制；且单一化的种质资源也让西瓜病害越来越严重，常给生产者带来无法挽回的经济损失。鉴于此，在西瓜遗传育种过程中，利用现代育种技术和方法创新种质资源，拓宽其遗传基础就显得尤为重要。

目前，利用物理诱变方法和化学诱变方法对作物进行诱变育种已成为选育新品种、创新种质资源的有效手段。化学诱变方法主要是利用化学诱变剂（如烷化剂、叠氮化物、碱基类似物等）对植物进行诱导变异，具有周期短、频率高、范围广等特点，能够在较短时间内获得大量突变体材料，这些材料直接或间接地应用于新品种和新种质资源的选育。甲基磺酸乙酯（EMS，ethyl methanesulfonste）是一种高效稳定且应用广泛的化学诱变剂，在诱变过程中，能够使DNA 分子发生较多点突变，染色体畸变减少，并通过置换其他分子中的氢原子使得一些碱基烷基化而诱导突变。大量研究结果表明，要获得良好的诱变效果，必须要有适宜的诱变剂量（诱变剂量=诱变液浓度×处理时间），通常把诱变处理后50.00%植株存活的剂量即半致死剂量作为选择依据。弭宝彬等研究发现EMS 诱变冬瓜种子时最佳的诱变条件为1.20%EMS 诱变12 h，此时冬瓜种子发芽率、成苗率分别为54.67%、51.83%，接近半致死剂量。黄东福等对农作物EMS 的诱变条件进行分析后表明大部分作物的EMS 诱变半致死剂量在1.00%以内，且处理时间集中在4～8 h 时，可以获得较好的诱变效果。

以开封市农林科学研究院的高代自交系石红为研究材料，采用6 个处理浓度（0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%）和5 个处理时间（4、10、12、14、16 h）相互组合的方式，对西瓜种子进行了EMS 诱变最佳条件的筛选，通过对诱变处理后种子的发芽率和相对发芽率进行分析，获得EMS诱变西瓜种子的最佳诱变剂量，为构建西瓜突变体库，创制新的种质资源，进而深入研究西瓜的基因组和拓宽西瓜的遗传背景奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试西瓜材料为高代自交系石红，由开封市农林科学研究院西瓜研究所提供。EMS 诱变剂（水剂）购自Sigma 公司。试验于2020 年7 月26 日至8 月初在开封大学信息工程学院农业物联网协同创新中心农业基础实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 EMS 溶液的配制方法 EMS 诱变剂用pH 7.0 的0.1 mol·L磷酸缓冲液配制成0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的溶液。

1.2.2 EMS 的处理方法 西瓜种子诱变前设计2种种子处理方式：指甲刀切口和不切口。将切口和不切口的西瓜种子对EMS 的敏感性进行测试：用0.40%和1.00%的EMS 溶液分别处理切口和不切口的西瓜种子各4 h 和10 h。每个处理用50 粒种子，3 次重复。

确定最佳的种子处理方式后，将试验设诱变浓度和诱变时间2 个因素，采用二因素完全随机区组设计方法，因素1 为EMS 诱变浓度，设6 个浓度水平，即0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%；因素2为诱变时间，设5 个诱变时间水平，即4、10、12、14、16 h。试验共30 个处理，3 次重复，每个处理用50粒种子。试验处理均以pH 7.0 的0.1 mol·L磷酸缓冲液处理作为对照，诱变结束后，用1.0 mol·L的硫代硫酸钠溶液终止反应，接着用0.1 mol·L的硫代硫酸钠溶液冲洗，再用蒸馏水清洗3 遍，将种子平铺于滤纸上沥水，后用纱布包好放置于28 ℃恒温培养箱中催芽。

1.2.3 测定发芽率 分别统计7 d 后的种子发芽数，计算发芽率和相对发芽率，筛选出EMS 溶液的半致死剂量，确定最佳的EMS 诱变浓度和时间。

发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%，相对发芽率=处理的实际发芽率/对应CK 的实际发芽率×100%。

1.3 数据处理

采用Excel 2016 处理试验数据并分析作图，使用IBM SPSS 22.0 统计软件采用LSD 法分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 EMS溶液对西瓜种子切口与不切口的影响

利用切口与不切口2 种处理方式对EMS 诱变西瓜种子的敏感性进行检测后发现（表1），0.40%的低浓度处理下，处理时间为4 h 时，与对照相比，切口与不切口2 种处理方式对西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率无影响，都是100%；但当浓度为0.40%，处理时间为10 h 时，切口西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率都比对照显著降低了4.00%，而不切口种子的实际发芽率和相对发芽率与对照相比无变化；当诱变浓度为1.00%，处理时间为4 h时，2 种处理方式对西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率都无显著变化；但当浓度为1.00%，处理时间为10 h 时，种子切口的处理方式使西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率都分别比对照显著下降了20.00%，而不切口的处理方式下西瓜种子的实际发芽率和相对发芽率仅下降了3.33%。由此可见，当诱变浓度较低且诱变时间较短时，种子不管是切口还是不切口对EMS 诱变剂都不敏感；当诱变浓度和诱变时间达到一定程度时，相同条件下，种子进行切口处理能够显著提高西瓜种子对EMS 诱变剂的敏感性。

表1 不同种子处理方式对西瓜种子发芽率的影响

2.2 诱变时间和诱变浓度对西瓜种子发芽率的影响

2.2.1 诱变时间对西瓜种子发芽率的影响 相同诱变浓度条件下，研究诱变时间对西瓜种子发芽率的影响（表2）发现，当诱变浓度为0.40%时，诱变时间分别为4、10、12 h 的西瓜种子相对发芽率与对照相比无显著差异，而诱变时间为14 h 和16 h 时的西瓜种子相对发芽率分别比对照显著降低了7.34%和11.78%；当诱变浓度分别为1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%时，诱变10、12、14、16 h 的西瓜种子相对发芽率均低于诱变4 h 的相对发芽率，且均达到了显著水平。以上结果表明，诱变浓度和诱变时间对西瓜种子的发芽率都有较大影响，当诱变浓度较低为0.40%时，诱变时间在短期内对西瓜种子发芽率的影响效果差异不明显，但超过一定时间后有显著的影响效果；当诱变浓度≥1.00%时，诱变时间≥10 h 的影响效果均显著低于诱变时间为4 h 的诱变效果。

表2 同一浓度下不同诱变时间对西瓜种子发芽率的影响

2.2.2 诱变浓度对西瓜种子发芽率的影响 相同诱变时间条件下，研究EMS 的诱变浓度对西瓜种子发芽率的影响发现，当诱变时间为4 h 时，诱变浓度为0.40%和1.00%的西瓜种子相对发芽率与对照相比无显著差异，而诱变浓度分别为1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的西瓜种子相对发芽率均显著低于对照（图1）；当诱变时间为10 h 和12 h 时，诱变浓度为0.40%的西瓜种子相对发芽率与对照相比均无显著变化，但1.00%～2.00%的西瓜种子相对发芽率都比对照低，且都达到了显著水平（图2、图3）；诱变14 h 和16 h 时，诱变浓度0.40%～2.00%的西瓜种子相对发芽率都显著低于对照（图4、图5）。由此可见，诱变时间和诱变浓度协同影响EMS 的诱变效果，诱变时间一定时，诱变浓度越高西瓜种子的相对发芽率越低；与对照相比，诱变时间较短、诱变浓度较低时对西瓜种子相对发芽率的影响不大，诱变浓度越高，影响越显著；当诱变时间较长时，低浓度的诱变效果依然不显著，但随着诱变浓度的增大，影响效果越来越明显，且均能够达到显著水平；当诱变时间足够长时，即使诱变浓度较低，诱变效果也较显著。

图1 不同EMS 浓度诱变4 h 对西瓜种子相对发芽率的影响

图2 不同EMS 浓度诱变10 h 对西瓜种子相对发芽率的影响

图3 不同EMS 浓度诱变12 h 对西瓜种子相对发芽率的影响

图4 不同EMS 浓度诱变14 h 对西瓜种子相对发芽率的影响

图5 不同EMS 浓度诱变16 h 对西瓜种子相对发芽率的影响

2.3 最佳诱变浓度和诱变时间的确定

最佳诱变剂量（包括诱变浓度和诱变时间）才能够达到最佳的诱变效果。本试验利用6 个诱变浓度和5 个诱变时间共30 个组合对EMS 诱变西瓜种子的剂量效应进行了分析（表2 和图1），当诱变浓度为1.20%，诱变时间分别为12、14、16 h 时，西瓜种子相对发芽率分别为50.38%、52.21%和51.97%；当诱变浓度为1.40%，诱变时间分别为12、14、16 h 时，西瓜种子相对发芽率分别为48.95%、49.97%和48.82%。由上述结果可知，当诱变浓度为1.20%～1.40%、诱变时间为12～16 h 时，西瓜种子的相对发芽率能够达到半致死剂量，以诱变浓度越低和诱变时间越短为最好的原则，获得最佳的诱变组合为诱变浓度1.20%、诱变时间12 h。

3 讨论和结论

最佳的诱变剂量是获得最佳突变频率，得到理想突变体的关键。而合适的诱变材料处理方式是降低诱变剂使用量和缩短诱变时间进而获得最佳诱变剂量的重要措施之一。康保珊等在利用EMS诱变瓠瓜种子的研究中发现，利用1.00% 的EMS诱变浓度诱变12 h，不开壳种子的相对发芽率能够达到99.20%，但开壳种子的相对发芽率却下降到了46.00%左右，对EMS 诱变的敏感性显著提高。在其他葫芦科作物中，甜瓜种子不切口且EMS 处理浓度在1.00%～3.00%之间的发芽率能够达到97.00%以上。本试验发现对西瓜种子进行不切口处理时，1.00%的诱变浓度下即使诱变时间达到10 h，种子相对发芽率依然能够达到96.67%，而切口处理后该条件下的种子相对发芽率下降到了80.56%，与前人研究结论类似，也进一步说明在进行EMS 诱变处理中，可以通过种子切口或者开壳的处理方式来提高种子对诱变剂的敏感性。

目前，关于是否存在低浓度、短时间的EMS 处理对植物种子或者幼苗有一定的促进作用还没有统一定论。李雪宝等研究表明低浓度的EMS 能够促进水稻种子的发芽势及幼苗生长发育。霍雅馨等在箭筈豌豆中发现EMS 的短时处理能够促进其幼苗生长。康保珊等在瓠瓜中发现低浓度、短时间的EMS 诱变处理能够促进开壳瓠瓜种子发芽率的提高。但王春语等在分析EMS 处理高粱种子的最佳诱变剂量中发现随着EMS 诱变时间的增长和EMS 诱变浓度的增加，高粱出苗率呈现出逐渐降低的趋势。孔德培等在棉花中也发现EMS 对棉花种子的萌发有抑制作用，EMS 浓度越大，处理时间越长，对种子发芽势和活力的抑制作用越显著。本试验中低浓度、短时间的EMS 处理后西瓜种子的相对发芽率与对照相比有所降低，但差异不显著。此外，多数研究也表明，高浓度的EMS 处理短期内会对细胞造成无法完全修复的生理损伤，并抑制植株的生长发育。本试验中同样发现高浓度的EMS 条件下，即使诱变时间较短也能够显著降低西瓜种子的相对发芽率。

EMS 是一种高效、稳定的化学诱变剂，具有成本低、操作简单、点突变频率高，而染色体畸变频率低等特点，且EMS 诱变多为显性，易于突变体筛选。目前，利用EMS 诱变来创新种质资源已在不同作物育种中有了广泛应用，但在该过程中，筛选出最佳的诱变剂量是获得最佳的诱变效果的前提。通常是以半致死剂量为标准，一般以50%的种子相对发芽率作为半致死剂量的指标。殷冬梅等以半致死剂量为选择标准，确定了2 个花生品种的最佳诱变组合，分别是中花5 号的0.90%诱变7 h 和1.20%诱变5 h，远杂9102 的0.60%诱变7 h和0.90%诱变7 h，不同品种最佳诱变组合不同。孔德培等利用EMS 诱变亚洲棉发现0.60%的EMS溶液处理8 h 时其种子的发芽率和发芽指数分别为51.00%和18.84，该组合下的诱变效果最佳。康保珊等对开壳瓠瓜种子的24 个浓度/时间处理组合的研究中，发现1.00%～2.00%的EMS 诱变浓度为瓠瓜最适宜诱变浓度，在此浓度范围内，诱变8～12 h 可达到半致死剂量，提高浓度需要相应缩短诱变时间。王学征等利用EMS 诱变西瓜种子发现1.80% 6 h 的组合、1.00% 9 h 的组合、1.40% 9 h 的组合和1.00%12 h 的组合发芽率均接近50%，并最终确定EMS 的最佳诱变条件为处理浓度1.00%且诱导时间9 h。本试验以半致死剂量为标准，通过6个诱变浓度和5 个诱变时间共30 个诱变处理组合发现，EMS 诱变浓度为1.20%～1.40%，诱变时间达到12 h～16 h 的组合都能够使西瓜种子相对发芽率达到50.00%左右，但以诱变浓度越低和诱变时间越短为原则获得最佳的诱变组合为诱变浓度1.20%和诱变时间12 h。本试验结果与王学征等的试验结果相比诱变浓度增大，诱变时间延长，出现该问题的原因可能是西瓜品种以及西瓜自身基因型的不同造成的。

大量研究已经证实，最佳的EMS 诱变条件有利于获得最佳的诱变效果，对于构建突变体库、筛选突变体材料有重要的作用。目前，关于西瓜EMS 诱变条件和诱变效果的研究相对较少，具体的诱变机制仍处于探究阶段。本试验中利用诱变浓度和诱变时间的不同处理组合，筛选到了EMS 诱变西瓜种子的最佳诱变剂量，为西瓜突变体库的构建和突变体材料的筛选提供了基础，但该条件下能否获得满意的变异率还有待进一步的验证。